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关于蛋白免疫的抗体选择问题
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一般来说，做Western blot只需要选择一抗和二抗就可以，比如说一抗是兔源的，二抗只需选择抗兔的就行了。 一样的道理，我想用抗体来做细胞免疫定位，就是利用抗体与蛋白结合，在电子显微镜下观察蛋白质的位置，二抗要选择金颗粒标记的才可以在点惊吓观察到。问题是：我的一抗是兔源的，而现有的金颗粒标记的二抗是 猴抗山羊， 不是抗兔的。那么我可不可以用碱性磷酸酶标记山羊抗兔的二抗先与一抗结合，然后用 金颗粒标记的猴抗山羊的二抗 与 碱性磷酸酶标记山羊抗兔的二抗 结合，从而间接地把一抗与金颗粒标记的二抗结合起来。 这个知识不太懂， 金颗粒标记的二抗比较贵，能省则省啊，请大侠们指点，谢谢啊！ |
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3楼2013-05-14 22:30:35
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2楼2013-05-14 22:24:21
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【答案】应助回帖
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nixilu110: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢你的解答，有所了解了 2013-05-15 14:12:39
nixilu110: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢你的解答，有所了解了 2013-05-15 14:12:39
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猴抗山羊抗体无法识别并结合山羊抗兔二抗。第一，二抗常常是拿这个动物抗体的Fc片段免疫另一种动物获得，所以你的碱性磷酸酶正好标记在这个部位就可能形成空间位阻效应而降低识别甚至不能识别。（当然也有抗专门其他部位的）第二，碱性磷酸酶分子量可能是80kDa,相对也比较大，形成空间位阻的可能性比较大。第三，碱性磷酸酶与抗体偶联时是偶联在-NH2（主要来自赖氨酸），是否Fc区标记的可能性更大（这个我不知道），当然这个标记一般是混合物，也就是说标记不同部位的混合，因为他们纯化一般是根据分子量大小进行纯化。 总之是碱性磷酸酶可能阻碍甚至消除了猴抗山羊抗体识别的山羊抗兔二抗的抗原决定簇，导致阴性结果。因此，建议你最好先仔细看说明书，另外可以找他们技术部的咨询，根据他们的建议或做或重新订购其他批号的抗体。 |
4楼2013-05-15 10:39:01
