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annsp

金虫 (正式写手)

[求助] 扩增50kB的片段时,设计引物需要注意哪些?

我想扩增50Kb的片段,存在的问题如下:
1、用什么酶,Takara的LA Taq是否可以?
2、设计引物的时候跟平时设计2-3kb的相比,是否有其他需要注意的地方?
3、因为是直接从真核生物的DNA上克隆的,有内含子,所以想用真核的表达体系,有没有合适的表达载体和宿主可以推荐?
请各位大侠指点!不胜感激!
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乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

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感谢参与,应助指数 +1
annsp(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-07 16:51:33
5okb???楼主怎么要扩这么长的片段啊,好像LA是办不到的,LA的说明书上写的是以λ DNA为模板是有效长度是35kb,人基因组为模板是17.5kb.其他的我也没做过,就不瞎说了~
一花一世界、一叶一菩提
2楼2013-05-07 12:02:36
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
annsp(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-07 16:51:42
50kb?你能扩出来才怪呢;
参考下文献是用cDNA还是全DNA,cDNA应该要短很多;如果内含子比较重要,那就没办法了
用真核还是原核与蛋白本身有关,比如有糖链之类的,必须要用真核,否则蛋白可能没活性
第三军团
3楼2013-05-07 15:05:22
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很明显楼主在做一件很有挑战性的事,希望成功之后来分享下经验啊。
我是胖虎,我是孩子王!
4楼2013-05-07 15:27:45
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