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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计
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崔永霞

铁虫 (小有名气)

[求助] 引物设计

各位高手，知道一个酶的完整的cDNA序列，如何根据这个完整的cDNA序列设计引物，用于PCR扩增。

[ Last edited by gyesang on 2013-5-3 at 19:46 ]
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
1楼 2013-05-03 12:06:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

一一8778

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by panyuzhu at 2013-05-04 11:58:36
什么都不学，就坐享别人手把手的教，楼上的你觉得他会好好看你的建议吗...

中国有句话叫什么来着……，我想不起来了！没有人教我们，我们怎么会有今天，自学成才的天才古往今来又有几人！！！
耐心的指导胜过指责！

难在复杂，高在简单！
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17楼2013-05-05 13:23:15
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HTGe

金虫 (小有名气)
★
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 好心态！ 2013-05-04 13:21:33
引用回帖:
7楼: Originally posted by panyuzhu at 2013-05-04 11:58:36
什么都不学，就坐享别人手把手的教，楼上的你觉得他会好好看你的建议吗...

呵呵，能帮就帮嘛，咱们不都是这样一步一步走过来的嘛
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8楼2013-05-04 12:17:12
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HTGe

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-05-04 20:01:12
非常感谢，我的邮箱是cuiyong.xia@163.com，以前没做过这方面的实验，有点迷茫，真的很感谢你这么热心！还有一个问题就是我设计好引物加完酶切位点之后就出现了引物二聚体和发夹结构，没加酶切位点之前是符合引物设 ...

教程已发送至你邮箱，请查收；
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

崔永霞
15楼2013-05-04 20:23:13
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普通回帖

乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+1, ★有帮助 2013-05-03 13:48:00
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-03 19:46:53
直接在这个cDNA的两端设计引物不就能扩出来了，加个酶切位点咯
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一花一世界、一叶一菩提
2楼2013-05-03 12:32:49
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乐乐3952 at 2013-05-03 12:32:49
直接在这个cDNA的两端设计引物不就能扩出来了，加个酶切位点咯

直接在两端设计的话，primer5显示不符合引物设计的要求，怎么办啊？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
3楼2013-05-03 13:47:47
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乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-05-03 13:47:47
直接在两端设计的话，primer5显示不符合引物设计的要求，怎么办啊？...

先设计好，自己再编辑下加个酶切位点就好啊
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一花一世界、一叶一菩提
4楼2013-05-03 14:08:10
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 01:35:49
你设计好了,再加酶切位点和保护碱基就好了...加了以后不用管那些二聚体什么的了...肯定会有的...然后P的时候分段式P就效果不错
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5楼2013-05-04 00:22:57
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HTGe

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 13:20:46
gyesang: 回帖置顶 2013-05-04 13:20:48
一般大家都习惯用Primer5来设计引物，教程网上有，如果你找不到，留邮箱给我，我发给你。引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length） ，产物长度（product length） ，序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,  用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition）等等。这些因素在Primer5的引物设计过程中都有评价指标，具体步骤在网上看看教程就行了，不难。
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6楼2013-05-04 11:25:16
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2013-05-04 11:58:36
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-04 19:27:36
楼上说的都挺好的，设计引物没有那么难，首先要先弄清楚，自己得到序列想干什么，然后在根据自己的实验目的去设计引物~~
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总有一天我要修改用户名。
9楼2013-05-04 13:43:45
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 乐乐3952 at 2013-05-03 14:08:10
先设计好，自己再编辑下加个酶切位点就好啊...

哦，我试试，谢啦！
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
10楼2013-05-04 19:48:26
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