| 查看: 2863 | 回复: 6 | ||
weekend883金虫 (小有名气)
|
[求助]
做过接合转移的童鞋来帮忙啊？ 已有1人参与
|
|
我才开始做接合转移，打算接合转移敲除基因，是链霉菌里面的，做了几次之后发现转化效率挺低的，大概一个平板上长2－3个接合子吧（一个平板含孢子108个），这个效率是不是很低啊，可以从哪些地方提高转化效率呢？ 将接合子挑至两种抗性板上后，大部分都只在阿伯拉抗性板上长，只有少部分在硫链丝菌素抗性板上长，大概5％左右在硫链丝菌素平板上长，这个是什么原因引起的呢？是不是因为硫链丝菌素浓度太高了，我加的终浓度是25ug/ml，童鞋帮忙分析下原因呗，谢谢大家。 接合转移操作步骤： 1） ET12567(含敲除质粒)按1％的接种量接种LB培养基（含50ug/ml apramycin, 25ug/ml chloramphenicol, 25ug/ml kanamycin，37℃培养过夜。过夜培养物按1％接种量接到含抗生素的LB培养基当中，37℃，220 rpm，培养至OD600＝0.4-0.6，约5 h。用等体积2*YT洗涤培养物，洗涤两次，将沉淀悬浮于1/10体积的2*YT中。 2） 链霉菌孢子悬浮于2*YT，50℃热激10min，37℃，150rpm，萌发2h。2*YT洗涤一次，悬浮于1/10体积的2*YT中。 3） 将ET12567和链霉菌孢子按照108：108的比例混匀，涂布平板，使每个平板含链霉菌孢子数约108个。 4） 涂布好的平板，30℃培养16-20h，覆盖硫链丝菌素（终浓度25ug/ml）和萘啶酮酸(终浓度50ug/ml)。培养4d，可见接合子。 5） 将接合子分别挑至apramycin抗性板和thiostrepton抗性板上，能在thiostrepton抗性板上生长而不在apramycin抗性板生长的即为双交换菌株。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有265人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 链霉菌接合转移
已经有13人回复
- pMD18-T载体与目的基因连接后构建的质粒能通过接合转移到一些难以转化的细菌中吗？
已经有8人回复
- 接合转移实验现象求助
已经有13人回复
- 【求助/交流】有做过接合转移的童鞋么？求助~！
已经有13人回复
2楼2013-06-19 15:19:17
weekend883
金虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1117
- 散金: 100
- 帖子: 130
- 在线: 78.1小时
- 虫号: 493325
- 注册: 2008-01-10
- 专业: 微生物遗传育种学
3楼2013-07-01 13:21:16
tlb1989
木虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1890.8
- 散金: 5
- 帖子: 38
- 在线: 33.1小时
- 虫号: 1838686
- 注册: 2012-05-29
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
4楼2013-11-20 20:09:22
5楼2015-05-13 08:37:51
6楼2016-01-31 20:51:28
7楼2016-11-24 08:21:27
40