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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过接合转移的童鞋来帮忙啊？
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weekend883

金虫 (小有名气)

[求助] 做过接合转移的童鞋来帮忙啊？ 已有1人参与

我才开始做接合转移，打算接合转移敲除基因，是链霉菌里面的，做了几次之后发现转化效率挺低的，大概一个平板上长2－3个接合子吧（一个平板含孢子108个），这个效率是不是很低啊，可以从哪些地方提高转化效率呢？
将接合子挑至两种抗性板上后，大部分都只在阿伯拉抗性板上长，只有少部分在硫链丝菌素抗性板上长，大概5％左右在硫链丝菌素平板上长，这个是什么原因引起的呢？是不是因为硫链丝菌素浓度太高了，我加的终浓度是25ug/ml，童鞋帮忙分析下原因呗，谢谢大家。

接合转移操作步骤：
1）        ET12567(含敲除质粒)按1％的接种量接种LB培养基（含50ug/ml apramycin, 25ug/ml chloramphenicol, 25ug/ml kanamycin，37℃培养过夜。过夜培养物按1％接种量接到含抗生素的LB培养基当中，37℃，220 rpm，培养至OD600＝0.4-0.6，约5 h。用等体积2*YT洗涤培养物，洗涤两次，将沉淀悬浮于1/10体积的2*YT中。
2）        链霉菌孢子悬浮于2*YT，50℃热激10min，37℃，150rpm，萌发2h。2*YT洗涤一次，悬浮于1/10体积的2*YT中。
3）        将ET12567和链霉菌孢子按照108：108的比例混匀，涂布平板，使每个平板含链霉菌孢子数约108个。
4）        涂布好的平板，30℃培养16-20h，覆盖硫链丝菌素（终浓度25ug/ml）和萘啶酮酸(终浓度50ug/ml)。培养4d，可见接合子。
5）        将接合子分别挑至apramycin抗性板和thiostrepton抗性板上，能在thiostrepton抗性板上生长而不在apramycin抗性板生长的即为双交换菌株。
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1楼 2013-05-02 17:18:33
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李宜鸿17

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-01 13:37:36
ETZ摇菌最好不要过夜摇吧，本来就是用来活化的，本人实验室做的时候都是摇到对数期开始转接
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2楼2013-06-19 15:19:17
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weekend883

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 李宜鸿17 at 2013-06-19 15:19:17
ETZ摇菌最好不要过夜摇吧，本来就是用来活化的，本人实验室做的时候都是摇到对数期开始转接

摇到对数期开始转接,再摇到od=0.3-0.4?这个有很大影响吗?
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3楼2013-07-01 13:21:16
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tlb1989

木虫 (初入文坛)
请问覆盖时候终浓度是按1ml无菌水计算还是按照平板内培养基的体积计算呢？
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4楼2013-11-20 20:09:22
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小夏ml

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by tlb1989 at 2013-11-20 20:09:22
请问覆盖时候终浓度是按1ml无菌水计算还是按照平板内培养基的体积计算呢？

同问，我们实验室是按培养基体积算的……
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5楼2015-05-13 08:37:51
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非常6+1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主 你做过硫链丝菌素的整合型载体吗，效率如何？我做了好几次 都不行 终浓度最低到5 都没有单菌长出来。但是 pSET152-Apr做的时候 轻松成功。
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6楼2016-01-31 20:51:28
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Dear97

新虫 (初入文坛)
楼主！我想请问一下！你的硫链丝菌素抗性基因是哪个质粒上的？

发自小木虫Android客户端
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7楼2016-11-24 08:21:27
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