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weekend883金虫 (小有名气)
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[求助]
做过接合转移的童鞋来帮忙啊？ 已有1人参与
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我才开始做接合转移，打算接合转移敲除基因，是链霉菌里面的，做了几次之后发现转化效率挺低的，大概一个平板上长2－3个接合子吧（一个平板含孢子108个），这个效率是不是很低啊，可以从哪些地方提高转化效率呢？ 将接合子挑至两种抗性板上后，大部分都只在阿伯拉抗性板上长，只有少部分在硫链丝菌素抗性板上长，大概5％左右在硫链丝菌素平板上长，这个是什么原因引起的呢？是不是因为硫链丝菌素浓度太高了，我加的终浓度是25ug/ml，童鞋帮忙分析下原因呗，谢谢大家。 接合转移操作步骤： 1） ET12567(含敲除质粒)按1％的接种量接种LB培养基（含50ug/ml apramycin, 25ug/ml chloramphenicol, 25ug/ml kanamycin，37℃培养过夜。过夜培养物按1％接种量接到含抗生素的LB培养基当中，37℃，220 rpm，培养至OD600＝0.4-0.6，约5 h。用等体积2*YT洗涤培养物，洗涤两次，将沉淀悬浮于1/10体积的2*YT中。 2） 链霉菌孢子悬浮于2*YT，50℃热激10min，37℃，150rpm，萌发2h。2*YT洗涤一次，悬浮于1/10体积的2*YT中。 3） 将ET12567和链霉菌孢子按照108：108的比例混匀，涂布平板，使每个平板含链霉菌孢子数约108个。 4） 涂布好的平板，30℃培养16-20h，覆盖硫链丝菌素（终浓度25ug/ml）和萘啶酮酸(终浓度50ug/ml)。培养4d，可见接合子。 5） 将接合子分别挑至apramycin抗性板和thiostrepton抗性板上，能在thiostrepton抗性板上生长而不在apramycin抗性板生长的即为双交换菌株。 |
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