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zhuqinjian

金虫 (小有名气)

[求助] SaII和BamHI双酶切切不开

我用T载体与目的片段连接后,导入JM109中,用菌落PCR也能P出目的片段,提取质粒后PCR也能P出来,电泳跑出来的片段也正确(环状片段跑出来有3条带),但是用SaII和BamHI双酶切就是切不出来,只有一条带。求大神指导啊?是不是只是单酶切了啊?为啥双酶切切不出来呢?
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冰封之real

银虫 (初入文坛)

我也遇到过类似情况。你可以检查一下用的buffer是否合适,有些酶虽然可以与其他酶作双酶切,但在共同buffer里面活性会降低。我建议你可以分步酶切一下试试,虽然麻烦,但酶切效果好
13楼2013-05-07 09:18:41
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, 有帮助, 单酶切做了下,发现Sal I没有切开,哎不知道怎么回事 2013-05-02 11:01:09
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-02 12:01:23
分别做单切,确定是那个酶不能工作!此外,PCR的鉴定时候是否有加入阴性与阳性对照,我想担心你所看到的片段是都就是目的片段!希望对你有用!
2楼2013-05-02 10:20:52
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+3, 有帮助, 我是用捷瑞的试剂盒提的质粒,我觉得应该不是这个问题吧 2013-05-02 11:02:21
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-02 12:01:31
酶切之前,样品质粒要进行除酶,除盐,除乙醇等处理。一般就是酚氯仿抽提,技术要过关,不要在后面醇沉时留下太多的乙醇。上面说的单酶切验证酶是否失效是可行的,但是样品必须干净。内切酶很受离子和乙醇等物质影响的。
3楼2013-05-02 10:50:02
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, 有帮助, 的确是这样的,我考虑重新连T载体再做一下,然后再送去测序 2013-05-02 11:03:49
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-02 12:01:38
gyesang: 回帖置顶 2013-05-02 12:01:46
用载体上的引物对插入片段测序,最靠谱
4楼2013-05-02 11:01:08
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