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yuguiyan至尊木虫 (文坛精英)
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流式测细胞周期的步骤和PBS配置方法
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 |
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小智野山参
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 相当热心，还很详细哦 2013-04-16 16:44:59
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PBS配制1L： NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4•12H2O 3.58g KH2PO4 0.27g 调pH至7.0-7.2,高压灭菌 细胞周期检测 (1) 细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基，细胞近80%融合时传代； (2) 制备细胞悬液：取对数生长期细胞，胰酶消化后，加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，吹打制成单个细胞悬液； (3) 细胞接种：细胞计数后以细胞数2×105个/孔接种到六孔板，加入适量的培养基至2mL/孔，静置待细胞沉到板底后放入培养箱于37℃ 、5% CO2培养； (4) 药物处理：细胞静置培养24h，观察细胞已完全贴壁后，分别给予不同浓度的药物（DMSO含量为1‰），阳性对照组给予。。。。，阴性对照组给予同体积的DMSO，每个浓度设两孔； (5) 收集细胞：培养48小时后用不含EDTA的胰酶消化细胞，并与原培养液一起离心收集细胞（4℃、1000g、5min），冰预冷的PBS重悬细胞并离心沉淀细胞； (6) 固定细胞：吸除上清液，可残留约50μL，避免吸走细胞，边震荡边加入1mL冰预冷的70%乙醇，轻轻吹打混匀细胞，于4℃固定过夜； (7) 收集细胞：离心收集细胞（4℃、1000g、5min），用冰预冷的PBS重悬一次并离心沉淀细胞； (8) 细胞染色：吸除上清液，可残留约50μL,避免吸走细胞，每个样品加入0.5mL配好的染色液（含PI，RNA酶，染色缓冲液），缓慢并充分重悬细胞沉淀，于37℃避光温浴30分钟； (9) 上机检测：染色完成后用流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光。 流式细胞仪分析： (1) 按流式细胞仪操作规程开启仪器，用FL2的荧光通道来采集PI的信号； (2) 取500μL样本转移到专用的流式上样管，上机前轻轻弹击试管底部混匀细胞，先用阴性对照组上机调试仪器； (3) 打开获取实验数据的软件CellQuest，确定DDM门（doublet discrimination module，黏连体辨别模式）的参数是FL2； (4) 分别画一个FSCvs.SSC散点图、FL2-Wvs.FL2-A散点图、FL2-A的直方图； (5) DNA分析时，FSC、SSC和FL2都使用线性模式采集信号，调节FL2的电压，使FL2-A的G1期细胞的峰位于200道数的位置上； (6) 实验条件调节好后可以上机检测，DNA检测时最好用低速收。 |
2楼2013-04-16 15:42:07
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