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bolysu

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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-04-15 16:28:58
原核基于sigma70的启动子分这么几个区域
activator结合位点(例如pBAD pLux,这个位点也可以放inhibitor,如pLtet  pLlac)
之后是-35区,pTac的是e coli的consensus序列 ttgaca(当然ttgact也可以 T7的pL就用的这个)
之后是-35到-10的spacer,这个区域可以放inhibitor,pTac在这里放了一个LacO1
-10区,pTac用得是consensus序列tataat(T7的pl是gatact)
-10之后到+10都可以放inhibitor,抑制效果不一(如pA1lacO1)  当然LacI和TetR的调控可以由一个远端的结合位点加强

在+1之后不要乱放东西,如果你不准备对你原有的Nterminal tag进行修正,那么只要包含原始的rbs序列就可以了
ATG往上数6个nt附近的agga类序列,总共留20个-30个nt就很保险了。
如果你要自己换得话。那么请使用rbs calculator计算或者用其他的5‘utr insulator进行设计

不过我看你要做敲初,那么是想看基因功能了?那样我建议你从头设计自己的质粒,完全没必要用那些改
2楼2013-04-15 11:02:18
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回头太难

银虫 (知名作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-04-15 11:02:18
原核基于sigma70的启动子分这么几个区域
activator结合位点(例如pBAD pLux,这个位点也可以放inhibitor,如pLtet  pLlac)
之后是-35区,pTac的是e coli的consensus序列 ttgaca(当然ttgact也可以 T7的pL就用的这 ...

高手~仰慕
3楼2013-04-15 20:00:56
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bolysu

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4楼2013-04-15 22:05:38
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

★ ★
bolysu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-04-29 14:23:52
从原贴你写的东西看,你应该先去看看关于e coli基因表达各部分构成的内容。往多克隆位点里放一个单独的启动子一点意义都没有。另外T7启动子和e coli的非常不同,保险起见,我宁可重新构建个质粒,大概连可能出的小问题算在内也就两周工作量。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2013-04-16 00:26:06
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bolysu

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6楼2013-04-16 08:49:00
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

★ ★
bolysu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-04-29 14:24:09
7楼2013-04-16 09:10:27
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

8楼2013-04-16 09:12:45
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fuding6

木虫 (小有名气)

楼主:pACYCDuet-1启动子是T7启动子,为什么不能在普通大肠杆菌中表达?pET系列都是T7启动子吧,他们就可以在普通的大肠杆菌里表达啊。
9楼2013-04-16 16:05:25
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bolysu

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10楼2013-04-16 16:56:43
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