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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 猪粪中细菌总DNA的提取
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zhoujlhn

铜虫 (初入文坛)

[求助] 猪粪中细菌总DNA的提取

小弟最近在提取猪粪中细菌的总DNA，老板说要自己摸索方法，没有考虑过用试剂盒，但是怎么提都没有提出来，请教各位前辈，有谁做过这一块的，请你给小弟我支支招！先谢谢了！下面是我用的方法：
样品的前处理：
称取0.3g粪样放入2ml离心管中，加入1.5mlPBS（ph8.0）溶液，旋涡振荡混匀，4℃，800rpm离心10min;吸上清液转入另一干净2ml离心管中，4℃， 1000rpm离心 10min;再将上清液转入另一干净 2ml离心管中，重复此步骤，直至离心后上清液有菌体浑浊感为止；最后将上清液4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清，收集沉淀。将沉淀用适量丙酮洗涤，并转入到 1.5ml离心管中，旋涡振荡混匀， 4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清。用丙酮洗涤两次后，收集沉淀自然干燥或吹干
细胞裂解及DNA抽提：
1、        经过前处理后的样品，加600μL TE，20μL溶菌酶 (100mg/ml)，轻轻颠倒混匀，于37℃放置 30min;
2、        加入15μL蛋白酶K，500μL裂解液，55℃温浴3-4h，每 20min轻轻颠倒混匀一次;
3、        然后加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻混成乳浊液， 4℃，13000rpm离心10min，小心吸上相至空管中;
4、        再加等体积的氯仿/异戊醇(24:l)轻轻颠倒混匀，13000rpm离心 10min，小心吸上相至空管中;加等体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜;
5、        将DNA样品取出，13000rpm离心20min，倒去异丙醇，用80%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心 10min，弃上清，并将异丙醇吹干;
6、        将DNA溶于60μL TE，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，于-70℃保存.
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一个人的奋斗！！！
1楼 2013-04-11 19:57:23
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品用液氮研磨两到三遍后0.5g或者0.75g；
裂解液 最好含有20% sds
65℃或者55℃  一到两小时 就够了

后面的 酚氯仿抽提 基本都一样 最后一步沉淀  个人觉得用3体积无水乙醇沉淀的比较干净，但是这个量比异丙醇可能少点。
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11楼2013-04-14 16:21:55
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