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jose123

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR杂带

最近抽提了鱼的组织肝脏、脾脏、头肾和血液的RNA，做溶菌酶基因的半定量PCR，设计了好几对引物（all none），奇怪的是：
在肝脏中只有一条目的带，其他组织中均有2条带。不知什么原因，求解释啊，新手金币不足，见谅！！！

222.jpg
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1楼 2013-04-04 19:50:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:25:52
下面的那条带可能是引物二聚体或者非特异扩增。感觉是你的基因在肝脏里面丰度高，所以P出来很亮的一条带。其他组织里面少，所以产生非特异扩增或者形成大量引物二聚体。
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2楼2013-04-05 00:28:22
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jose123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-05 00:28:22
下面的那条带可能是引物二聚体或者非特异扩增。感觉是你的基因在肝脏里面丰度高，所以P出来很亮的一条带。其他组织里面少，所以产生非特异扩增或者形成大量引物二聚体。

dimer的可能性感觉很小，因为多出的条带还是比较大的，差不多100bp。应该也可以排除引物的问题。至于非特异性，我也跑了梯度，那条带还是消除不了。（感觉是你的基因在肝脏里面丰度高，所以P出来很亮的一条带。为什么丰度高就不会有非特异性？）
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3楼2013-04-05 21:58:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jose123: 金币+4, ★有帮助 2013-04-05 23:53:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by jose123 at 2013-04-05 21:58:21
dimer的可能性感觉很小，因为多出的条带还是比较大的，差不多100bp。应该也可以排除引物的问题。至于非特异性，我也跑了梯度，那条带还是消除不了。（感觉是你的基因在肝脏里面丰度高，所以P出来很亮的一条带。为什 ...

引物二聚体一般是比你跑出来的稍微小一点，所以我不好区分是否是引物二聚体或者是非特异性。丰度高的活说明模板浓度高，形成引物二聚体或者引物与其他非特异性结合的几率降低。
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4楼2013-04-05 23:32:39
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jose123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-05 23:32:39
引物二聚体一般是比你跑出来的稍微小一点，所以我不好区分是否是引物二聚体或者是非特异性。丰度高的活说明模板浓度高，形成引物二聚体或者引物与其他非特异性结合的几率降低。...

谢谢！
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5楼2013-04-05 23:48:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jose123 at 2013-04-05 23:48:54
谢谢！...

忘记说了，你可以试试不加模板，其他PCR组分相同，如果还有下面的带，说明是引物二聚体。如果没有了，可能是引物与模板有非特异结合。
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6楼2013-04-06 00:02:09
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jose123

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-06 00:02:09
忘记说了，你可以试试不加模板，其他PCR组分相同，如果还有下面的带，说明是引物二聚体。如果没有了，可能是引物与模板有非特异结合。...

不加模板，pCR除加样外，程序设置页还是一样吗
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7楼2013-04-06 08:37:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jose123 at 2013-04-06 08:37:25
不加模板，pCR除加样外，程序设置页还是一样吗...

是的。就是看看下面的带是不是引物自身聚合形成的。
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8楼2013-04-06 11:00:34
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