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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » HPLC 流动相的操作
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chenhw06

金虫 (正式写手)

[交流] HPLC 流动相的操作

请问大家，HPLC流动相是4：1的乙腈和水。之前都是先混合再过滤超声到一个瓶子，这次想省事，就分别过滤用两个瓶子装着，然后将设置A（乙腈）管道80%，B（水）管道20%，混合。（两者混合的时候应该会产生起泡，对柱子什么有没有影响？）你们一般都是怎么做的呐？
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1楼 2013-04-02 00:03:08
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akosrios

铁杆木虫 (知名作家)
★
chenhw06: 金币+1 2013-04-02 10:27:25
引用回帖:
7楼: Originally posted by chenhw06 at 2013-04-02 09:44:13
色谱图很有问题啊，配的纯溶液，乙腈做溶剂。就是这样的，不知道是什么问题？

2.png
...

用的什么色谱柱

如果是反相柱，80%的乙腈洗脱太强，从图上看楼主的物质几乎没有保留，适当降低乙腈比例，或者使用梯度洗脱

另外，尽量用流动相或者水相溶解样品，不要用纯乙腈，容易有溶剂效应影响峰型
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9楼2013-04-02 09:51:40
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ying_cheng

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西湖醉鱼: 金币+1, 欢迎常来分析版 2013-04-06 22:05:11
先做一个溶剂的空白对比一下吧，看是不是溶剂引起的
如果这个峰是你的目标物，那保留也太弱了，峰型也不对，目前的这个流动相体系可能不合适，如果是反相柱的话，乙腈含量太高了。
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21楼2013-04-02 12:26:14
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普通回帖

BUU-2011

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenhw06: 金币+1 2013-04-02 10:27:31
如果使用前乙腈和水都超声脱气了，这样做是没有问题的，不过不知道你是哪个型号的机子，最好把机子的在线脱气提前打开，in case。
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2楼2013-04-02 07:42:05
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wy1518

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenhw06: 金币+1 2013-04-02 10:27:35
你的仪器有在线脱气机吗？有的话就不用担心 没有的话还是要分别脱气 减少混合时的气泡量 另外流动相不要放在温度高的地方和阳光直射的地方

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-04-02 07:45:33
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BUU-2011 at 2013-04-02 07:42:05
如果使用前乙腈和水都超声脱气了，这样做是没有问题的，不过不知道你是哪个型号的机子，最好把机子的在线脱气提前打开，in case。

使用前都超声了，用的是Waters 2695.在线脱气一直都是开着的。不过的色谱图不知道怎么回事是这样的？是纯品，准备做标曲的，这个到底是什么情况啊？
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4楼2013-04-02 09:40:23
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akosrios

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenhw06: 金币+1 2013-04-02 10:26:47
chenhw06: 金币+1 2013-04-02 10:27:39
这种操作没有什么问题。色谱图是哪样的？
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5楼2013-04-02 09:42:37
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wy1518 at 2013-04-02 07:45:33
你的仪器有在线脱气机吗？有的话就不用担心 没有的话还是要分别脱气 减少混合时的气泡量 另外流动相不要放在温度高的地方和阳光直射的地方

流动相就放在分离系统的上面，温度就是室温吧，大概20多度。可以吗？
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6楼2013-04-02 09:42:47
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by akosrios at 2013-04-02 09:42:37
这种操作没有什么问题。色谱图是哪样的？

色谱图很有问题啊，配的纯溶液，乙腈做溶剂。就是这样的，不知道是什么问题？

2.png
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7楼2013-04-02 09:44:13
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BUU-2011 at 2013-04-02 07:42:05
如果使用前乙腈和水都超声脱气了，这样做是没有问题的，不过不知道你是哪个型号的机子，最好把机子的在线脱气提前打开，in case。

忘记附图了，就是下面那个。
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8楼2013-04-02 09:45:06
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by akosrios at 2013-04-02 09:51:40
用的什么色谱柱

如果是反相柱，80%的乙腈洗脱太强，从图上看楼主的物质几乎没有保留，适当降低乙腈比例，或者使用梯度洗脱

另外，尽量用流动相或者水相溶解样品，不要用纯乙腈，容易有溶剂效应影响峰型...

用的C8柱，因为溶质不溶于水，所以用纯乙腈溶的。乙腈跟水的配比是在小木虫上查的，因为没有文献提到。我现在去调成3：1和2:1试一下。不过不用流动相溶解样品应该没有很大问题吧?因为我前面做的一批实验都是用乙腈定容的，现在要是改成流动相，样品检测就木办法了。
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10楼2013-04-02 10:00:24
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huangq816

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
chenhw06: 金币+1 2013-04-02 10:27:08
很可能是溶剂效应，减少进样量，或者用初始比例的流动相当成稀释液。
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11楼2013-04-02 10:22:19
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by huangq816 at 2013-04-02 10:22:19
很可能是溶剂效应，减少进样量，或者用初始比例的流动相当成稀释液。

我的进样量是10微升，这个大吗？稀释液我看的文献他们都是用的纯乙腈，而且我样品是这样处理保存的，所以实不到万不得已我不想改变啊。
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12楼2013-04-02 10:25:53
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zhangyun3235

金虫 (初入文坛)
★
chenhw06(金币+1): 谢谢参与
溶质一点都不溶于水吗？
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13楼2013-04-02 10:31:59
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhangyun3235 at 2013-04-02 10:31:59
溶质一点都不溶于水吗？

对啊，我试过配0.01 mg/mL的溶液，不溶，加热到60℃，才溶一部分。
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14楼2013-04-02 10:37:19
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by liuyue369 at 2013-04-02 10:43:55
祝福

亲，少领点金币撒
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18楼2013-04-02 10:53:48
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zhangyun3235

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by chenhw06 at 2013-04-02 10:37:19
对啊，我试过配0.01 mg/mL的溶液，不溶，加热到60℃，才溶一部分。...

是不是柱子被污染了啊
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19楼2013-04-02 11:50:41
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by zhangyun3235 at 2013-04-02 11:50:41
是不是柱子被污染了啊...

木有，新柱用了没几次。刚才看了下，好像确实是流动相配比有问题，用3:1和2：1试了下好像可以了。
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20楼2013-04-02 12:13:48
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by ying_cheng at 2013-04-02 12:26:14
先做一个溶剂的空白对比一下吧，看是不是溶剂引起的
如果这个峰是你的目标物，那保留也太弱了，峰型也不对，目前的这个流动相体系可能不合适，如果是反相柱的话，乙腈含量太高了。

用的反相柱，应该是乙腈含量太高了。后面降低了跑了一下，好了很多。就是吸收比较大的210 nm峰形不尖，峰头有点宽？不过还好278 nm峰形还不错。
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22楼2013-04-02 12:38:24
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724849361

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
乙腈比例太大了……反正我们是很少用如此大比例的乙腈。色谱条件还是自己摸索出来的好，别人的只能作为参考，毕竟不同的机器、不同的柱子响应是不同的。
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23楼2013-04-02 14:33:37
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hua132201146

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1.如果怀疑混合的时候产生气泡，那么可以查看压力线，管路系统中如果进气泡的话，在压力线会有所体现的；
2.色谱峰形差，并且样品为纯品，大致可以认为是乙腈的溶剂峰引起的，采集波长应该是低于220nm的。
建议：将乙腈的比例降低至60或者50，同时设置多通道的采集信号，观察主峰的峰形有没有改善。
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24楼2013-04-02 15:15:31
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bomblei

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
多做几次就好了，这个需要摸条件的。加油
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chenhw06
25楼2013-04-02 15:30:23
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 724849361 at 2013-04-02 14:33:37
乙腈比例太大了……反正我们是很少用如此大比例的乙腈。色谱条件还是自己摸索出来的好，别人的只能作为参考，毕竟不同的机器、不同的柱子响应是不同的。

确实是大了，降低了后就好了。
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26楼2013-04-02 15:33:17
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huangq816

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by chenhw06 at 2013-04-02 10:25:53
我的进样量是10微升，这个大吗？稀释液我看的文献他们都是用的纯乙腈，而且我样品是这样处理保存的，所以实不到万不得已我不想改变啊。...

那你试试5uL看看，如果还是这样，就可以排除溶剂效应，从其他方面找找原因。
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27楼2013-04-02 15:42:01
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by hua132201146 at 2013-04-02 15:15:31
1.如果怀疑混合的时候产生气泡，那么可以查看压力线，管路系统中如果进气泡的话，在压力线会有所体现的；
2.色谱峰形差，并且样品为纯品，大致可以认为是乙腈的溶剂峰引起的，采集波长应该是低于220nm的。
建议： ...

流动相我最后采用2：1，做出来标曲还可以。采集波长应该低于220 nm是什么意思呐？
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28楼2013-04-02 15:48:51
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chenhw06

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
25楼: Originally posted by bomblei at 2013-04-02 15:30:23
多做几次就好了，这个需要摸条件的。加油

谢谢谢谢
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29楼2013-04-02 15:49:13
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by huangq816 at 2013-04-02 15:42:01
那你试试5uL看看，如果还是这样，就可以排除溶剂效应，从其他方面找找原因。...

嗯啊，我试一下哈。
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30楼2013-04-02 15:50:26
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libaoguo

铁杆木虫 (小有名气)
主要看泵的型号了 如果是2元高压泵 就不会有问题
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31楼2013-04-03 15:17:20
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by libaoguo at 2013-04-03 15:17:20
主要看泵的型号了 如果是2元高压泵 就不会有问题

我们的是四元梯度泵，配有真空脱气机，没问题吧
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32楼2013-04-03 15:37:49
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libaoguo

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
32楼: Originally posted by chenhw06 at 2013-04-03 15:37:49
我们的是四元梯度泵，配有真空脱气机，没问题吧...

四元梯度泵就是低压的了，效果没有二元的好。我用四元泵走过甲醇-水，没有问题，你这个开了真空脱气，应该没有问题。你柱温不高吧？
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chenhw06
33楼2013-04-03 16:23:26
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by akosrios at 2013-04-02 09:51:40
用的什么色谱柱

如果是反相柱，80%的乙腈洗脱太强，从图上看楼主的物质几乎没有保留，适当降低乙腈比例，或者使用梯度洗脱

另外，尽量用流动相或者水相溶解样品，不要用纯乙腈，容易有溶剂效应影响峰型...

您帮忙看一下谱图吧，这个是用乙腈和水2：1做流动相测的，乙腈为溶剂，最后标曲R2=0.9968（278 nm ）。①标样在210 nm吸收比较大，但是峰行不好，下面是1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.3 mg/mL、0.1 mg/mL时候的峰，1和0.5峰头比较圆，这是不是浓度比较大的原因？0.3峰还好，0.1峰前伸，这个是因为什么？（乙腈为溶剂产生的？）②278 nm的时候吸收较弱，但1 mg/mL~0.3 mg/mL峰形都蛮好，不过0.1 mg/mL峰前伸，这是因为什么哪？这个测的标曲可以用吗？请您指点啊。

1mg/mL（210nm）.png



0.5mg/mL（210nm）.png



0.3mg/mL（210nm）.png



0.1mg/mL（210nm）.png



1mg/mL（278nm）.png



0.3mg/mL（278nm）.png



0.1mg/mL（278nm）.png
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34楼2013-04-03 16:50:23
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chenhw06

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
33楼: Originally posted by libaoguo at 2013-04-03 16:23:26
四元梯度泵就是低压的了，效果没有二元的好。我用四元泵走过甲醇-水，没有问题，你这个开了真空脱气，应该没有问题。你柱温不高吧？...

柱温是30℃，我刚才在网上看了一下四元泵的图，看到是下脱气后按比例混合，这点不明白，脱气之后混合不会又产生起泡了吗？如果是有机相跟水混合。
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35楼2013-04-03 16:53:42
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swallow13

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
36楼2013-04-03 17:44:44
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swallow13

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
37楼2013-04-03 17:46:07
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
37楼: Originally posted by swallow13 at 2013-04-03 17:46:07
lz用的是Waters e2695的泵吧？只要在线脱气正常 在线混合是没有问题的 我有一个样品是走乙腈50→95的梯度 运行正常...

确实是Waters 2695，混合没问题就好
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38楼2013-04-03 18:40:51
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1229240180

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该会有一定影响！
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39楼2013-04-03 19:19:18
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
36楼: Originally posted by swallow13 at 2013-04-03 17:44:44
从谱图来看 1mg/ml和0.5mg/ml浓度显然大了 0.1和0.3mg/ml浓度的峰都有一点峰前伸 只是0.1的峰放大倍数多一点 所以看起来比较明显 建议lz将不对称度等参数也一并贴上来 检测波长的选择不一定要选择最大吸收波长 但要 ...

说的太专业了，听的云里雾里啊。不对称度、理论塔板是要自己算出来吗
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40楼2013-04-03 19:31:19
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
39楼: Originally posted by 1229240180 at 2013-04-03 19:19:18
应该会有一定影响！

。。。。。决定以后混合好再过滤
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41楼2013-04-03 19:32:49
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yugijiang

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这可能是你的洗脱强度太大了，试试调节下比例吧，还有确认下色谱柱的性能
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42楼2013-04-04 14:40:34
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
42楼: Originally posted by yugijiang at 2013-04-04 14:40:34
这可能是你的洗脱强度太大了，试试调节下比例吧，还有确认下色谱柱的性能

最后调到了2：1，基本是是没问题，就是几个浓度峰形有点前伸。C8柱刚用了几次，性能应该还好吧。
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43楼2013-04-05 10:53:14
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swt1898

铁虫 (著名写手)
液相就要多摸索

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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44楼2013-04-06 10:58:06
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swt1898

铁虫 (著名写手)
液相就要多摸索

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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45楼2013-04-06 10:58:14
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chenhw06

金虫 (正式写手)
引用回帖:
44楼: Originally posted by swt1898 at 2013-04-06 10:58:06
液相就要多摸索

是啊，可是我的重点不是液相呀
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46楼2013-04-06 11:07:20
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liuyue36915楼
2013-04-02 10:43   回复  
chenhw06(金币+1): 谢谢参与
祝福 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
liuyue36916楼
2013-04-02 10:43   回复  
chenhw06(金币+1): 谢谢参与
祝福 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
liuyue36917楼
2013-04-02 10:43   回复  
chenhw06(金币+1): 谢谢参与
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