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神话米亚新虫 (初入文坛)
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[求助]
虫友们！请教大家关于肠道菌DNA提取的问题
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以下是我的提取过程，不吝赐教哈 1）将肠道研磨物500r/min离心5min,收集上清液，重复2次。将肠道微生物12000r/min离心10min沉淀，去上清液。加入480μL TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。 2）加入20μL 100mg/ml溶菌酶，使终浓度为4mg/mL，37°C温育20min。 3）加入30μL 10% SDS 和5μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，56°C温育40min。（期间可以轻柔振荡几次帮助裂解。） 4）加入100μL 5mol/LNaCl，充分混匀，再加入85μL CTAB/NaCl，混匀，65°C温育10min。 5）等体积（720ul）苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提两次，12000r/min离心5min，将上清液转移至新EP管中。第一次抽提后，加5μL 25mg/mlRNA酶，振荡均匀，37度水浴8min，之后进行第二次抽提。 6）加入0.6体积（450ul）异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来(冰箱静至半小时让DNA沉淀)12000r/min离心10min。 7）加入1mL 70%冰乙醇洗涤，（涡旋震荡起沉淀数秒钟）离心5min，弃上清，自然通风干燥20min，重溶于10μL的TE缓冲液中（65°C下水浴1小时重溶）。 将提取的总DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 希望大家帮我看看有没有问题哈。让我比较头疼是RNA酶要在什么时候加比较好，因为加完要让它起作用，又要最终除去。有考虑过在第三、四步的时候加，但是RNA酶怕蛋白酶K 和CTAB。所以就在抽提第一次后加，再在第二次抽提的时候除去。不知道可不可以？另外的问题是大家帮我看看各种试剂加的量有没有特别不合适的地方？》 |
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