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崔士元金虫 (正式写手)
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[求助]
重叠延伸第一轮验证了目的条带，转化后，第二轮总是P不出目的条带，验证不了
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小弟初做PCR，请各位师兄师姐帮帮忙 做基因敲除实验，分别P出目的条带上下同源臂，做重叠延伸验证时，目的条带有900bps，连接载体后转化Top10，挑出阳性菌落做第二轮验证时就只能P出500bps大小的条带，有时会有个1000bps左右的条带，但是不清楚，连续做了四次，每次就是这个结果，不知道是什么原因。 请有经验的师兄师姐给予解答，多谢！ |
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gyesang
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6楼2013-03-17 01:35:36
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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关于你问题表述中的几个问题： 1. “做基因敲除实验，分别P出目的条带上下同源臂，做重叠延伸验证时，目的条带有900bps，” 做重叠延伸验证是什么意思，你的目的就是做overlap PCR将上下（左右）同源臂连在一切，跑胶回收融合后的片段 2. “连接载体后转化Top10，挑出阳性菌落做第二轮验证时” 什么叫第二轮验证，也就是你将上面的overlap PCR的回收产物连上了载体，转化，然后做了菌落PCR，发现有些菌落扩出来的条带（500bp）与预期不符(900bp)，这种情况，有可能你在跑胶回收overlap PCR产物的时候，产物回收不纯，混入了两个同源臂的DNA并连入了载体 你的两个同源臂的大小分别是多少？你500bp的，抑或1000bp的菌落培养后抽质粒送测序了没有？ 你连续做了四次，每次你都是从PCR同源臂开始的吗？ |
2楼2013-03-16 02:03:59
崔士元
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3楼2013-03-16 14:41:51
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4楼2013-03-16 15:35:50