应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸第一轮验证了目的条带，转化后，第二轮总是P不出目的条带，验证不了
51/1返回列表
查看: 1236  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

崔士元

金虫 (正式写手)

[求助] 重叠延伸第一轮验证了目的条带，转化后，第二轮总是P不出目的条带，验证不了

小弟初做PCR，请各位师兄师姐帮帮忙
做基因敲除实验，分别P出目的条带上下同源臂，做重叠延伸验证时，目的条带有900bps，连接载体后转化Top10，挑出阳性菌落做第二轮验证时就只能P出500bps大小的条带，有时会有个1000bps左右的条带，但是不清楚，连续做了四次，每次就是这个结果，不知道是什么原因。
请有经验的师兄师姐给予解答，多谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
男人，就要对自己狠一点！
1楼 2013-03-15 22:57:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 崔士元 at 2013-03-16 23:27:44
能看到的，还很亮，但是也会有500的条带，但是比较模糊，今天把900片段拿出来重新P了，900的条带很亮，但是也会有500的条带，和师姐讨论，觉得应该是引物和Top10相似基因的非特异结合，因为我们缺失的基因在Top10中 ...

那是有这种可能性存在的
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-03-17 01:35:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于你问题表述中的几个问题：
1. “做基因敲除实验，分别P出目的条带上下同源臂，做重叠延伸验证时，目的条带有900bps，”
做重叠延伸验证是什么意思，你的目的就是做overlap PCR将上下（左右）同源臂连在一切，跑胶回收融合后的片段

2. “连接载体后转化Top10，挑出阳性菌落做第二轮验证时”
什么叫第二轮验证，也就是你将上面的overlap PCR的回收产物连上了载体，转化，然后做了菌落PCR，发现有些菌落扩出来的条带（500bp）与预期不符(900bp)，这种情况，有可能你在跑胶回收overlap PCR产物的时候，产物回收不纯，混入了两个同源臂的DNA并连入了载体

你的两个同源臂的大小分别是多少？你500bp的，抑或1000bp的菌落培养后抽质粒送测序了没有？

你连续做了四次，每次你都是从PCR同源臂开始的吗？
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-03-16 02:03:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

崔士元

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-16 02:03:59
关于你问题表述中的几个问题：
1. “做基因敲除实验，分别P出目的条带上下同源臂，做重叠延伸验证时，目的条带有900bps，”
做重叠延伸验证是什么意思，你的目的就是做overlap PCR将上下（左右）同源臂连在一切， ...

这位仁兄好，上游同源臂长421，下游482，每次都是从同源臂开始P的，如果是混入了下游同源臂，可以解释500bps产生原因，但是挑选阳性克隆，应该能P出目的片段吧，不知道为什么有时候跑出的是清一色的500片段
赞一下 回复此楼
男人，就要对自己狠一点！
3楼2013-03-16 14:41:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔士元 at 2013-03-16 14:41:51
这位仁兄好，上游同源臂长421，下游482，每次都是从同源臂开始P的，如果是混入了下游同源臂，可以解释500bps产生原因，但是挑选阳性克隆，应该能P出目的片段吧，不知道为什么有时候跑出的是清一色的500片段...

你在做两个同源臂Overlap的时候，能看到903bp的条带吗？
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-03-16 15:35:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 8/400 2026-09-02 02:42 by Leogzhya
[基金申请] 面上函评意见出来了，像什么等级？ 20+4 Tsingking1 2026-08-27 17/850 2026-09-01 19:51 by 超级无敌华子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +5 bjdxyxy 2026-08-26 5/250 2026-09-01 17:54 by 小伟大博士
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭