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ice清玉

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组菌再次活化不表达的原因都有什么

我的重组菌三个月前还能诱导出来，而且诱导的挺好，18℃，28℃，37℃三个温度，五个IPTG浓度都表达，且表达量都很多（都是在包涵体中表达）。现在把三个月前保存菌种拿出来活化再诱导，一点儿蛋白都不表达了。然后我用当时构建好保存的质粒重新转化了表达菌株，诱导还是不表达。我想不出来是哪里出了问题，求各位大神指点一二。跪谢...TAT
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1楼 2013-03-13 19:55:10
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助 2013-03-13 20:25:00
匪夷所思~~碰到过以下情况，可能影响：
1.IPTG配错了。有个MM，配高了十倍，结果就悲剧了。所以，检查你所有的试剂、培养基等，确保没有错误的地方。
2.质粒被重组了。要不要再跑一下你的质粒看看完整性，以及插入片段大小是否正确？
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2楼2013-03-13 20:13:50
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ice清玉

新虫 (初入文坛)
3楼2013-03-13 20:16:16
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ice清玉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 20:13:50
匪夷所思~~碰到过以下情况，可能影响：
1.IPTG配错了。有个MM，配高了十倍，结果就悲剧了。所以，检查你所有的试剂、培养基等，确保没有错误的地方。
2.质粒被重组了。要不要再跑一下你的质粒看看完整性，以及插入 ...

1. IPTG是以前用过的，没有重新配。
2. 质粒用之前做了PCR，片段大小没有问题，现在送去测序了，等结果，我个人认为应该不会有什么问题。

我打算明天借别人一管IPTG再试试，难不成我的IPTG在某种我不知的情况下失去作用了？要不我实在想不出还能有什么问题了....
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4楼2013-03-13 20:19:03
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你用的是什么载体和什么宿主菌？我用pET系列和BL21的话，如果表达很多的话，通常都有泄漏表达，没加IPTG就表达了。你也没看到这种状况？
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5楼2013-03-13 20:22:38
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ice清玉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 20:13:50
匪夷所思~~碰到过以下情况，可能影响：
1.IPTG配错了。有个MM，配高了十倍，结果就悲剧了。所以，检查你所有的试剂、培养基等，确保没有错误的地方。
2.质粒被重组了。要不要再跑一下你的质粒看看完整性，以及插入 ...

培养基不能出问题吧....培养基出问题，菌都摇不起来....而且期间我还借过别人的培养基用，也是一样的结果....

这样就没有什么其他的试剂了吧...就只有IPTG了...这个出问题的可能也微乎其微...
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6楼2013-03-13 20:24:51
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ice清玉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 20:22:38
你用的是什么载体和什么宿主菌？我用pET系列和BL21的话，如果表达很多的话，通常都有泄漏表达，没加IPTG就表达了。你也没看到这种状况？

载体是PET-28a，宿主菌是DE3（貌似就是BL21吧），我第一次表达的时候忘了加对照了，不知道有没有泄露表达，反正现在加不加的跑胶出来都一样了....
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7楼2013-03-13 20:28:09
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