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ice清玉

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组菌再次活化不表达的原因都有什么

我的重组菌三个月前还能诱导出来,而且诱导的挺好,18℃,28℃,37℃三个温度,五个IPTG浓度都表达,且表达量都很多(都是在包涵体中表达)。现在把三个月前保存菌种拿出来活化再诱导,一点儿蛋白都不表达了。然后我用当时构建好保存的质粒重新转化了表达菌株,诱导还是不表达。我想不出来是哪里出了问题,求各位大神指点一二。跪谢...TAT
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ice清玉

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 20:13:50
匪夷所思~~碰到过以下情况,可能影响:
1.IPTG配错了。有个MM,配高了十倍,结果就悲剧了。所以,检查你所有的试剂、培养基等,确保没有错误的地方。
2.质粒被重组了。要不要再跑一下你的质粒看看完整性,以及插入 ...

1. IPTG是以前用过的,没有重新配。
2. 质粒用之前做了PCR,片段大小没有问题,现在送去测序了,等结果,我个人认为应该不会有什么问题。

我打算明天借别人一管IPTG再试试,难不成我的IPTG在某种我不知的情况下失去作用了?要不我实在想不出还能有什么问题了....
4楼2013-03-13 20:19:03
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助 2013-03-13 20:25:00
匪夷所思~~碰到过以下情况,可能影响:
1.IPTG配错了。有个MM,配高了十倍,结果就悲剧了。所以,检查你所有的试剂、培养基等,确保没有错误的地方。
2.质粒被重组了。要不要再跑一下你的质粒看看完整性,以及插入片段大小是否正确?
2楼2013-03-13 20:13:50
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你用的是什么载体和什么宿主菌?我用pET系列和BL21的话,如果表达很多的话,通常都有泄漏表达,没加IPTG就表达了。你也没看到这种状况?
5楼2013-03-13 20:22:38
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ice清玉

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 20:13:50
匪夷所思~~碰到过以下情况,可能影响:
1.IPTG配错了。有个MM,配高了十倍,结果就悲剧了。所以,检查你所有的试剂、培养基等,确保没有错误的地方。
2.质粒被重组了。要不要再跑一下你的质粒看看完整性,以及插入 ...

培养基不能出问题吧....培养基出问题,菌都摇不起来....而且期间我还借过别人的培养基用,也是一样的结果....

这样就没有什么其他的试剂了吧...就只有IPTG了...这个出问题的可能也微乎其微...
6楼2013-03-13 20:24:51
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