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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET-30a(+)不表达
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jackhua17

禁虫 (小有名气)
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本帖内容被屏蔽
11楼2013-03-15 02:08:58
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zhanggu

银虫 (小有名气)
我用的也是pet-30a，插入2.3kb的基因，也没表达。
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12楼2013-03-15 15:34:42
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qeotnd

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
13楼2013-03-15 17:24:23
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jackhua17 at 2013-03-15 02:08:58
PET-30 是有 N-terminal histag 吧。你加IPTG后induce 温度是多少？我一般20oC 12小时。再就是确信你的protein没有表达还是沉淀了。再就是来源比较远的基因不表达太正常不过了，查查其它类似基因表达的文献。

我都是在37度下培养6-8小时的
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14楼2013-03-16 11:09:45
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Jathan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你可以降低一下温度，一般降低温度可能会促进重组蛋白的表达，另外IPTG对细菌本身具有一定毒性，建议多试几个浓度梯度，而且有时载体选择也会对你的蛋白表达起到一定影响，总之需要尝试，祝好运！
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15楼2013-03-19 09:37:56
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1.是否有包涵体-如果有，降低IPTG含量，降低诱导温度
2.密码子是否优化（有否稀有密码子）-如果有，换菌株，如rosetta
3.有没有移码？
4.如果是表达量少，OD600到1再加IPTG，诱导时间和温度也要优化
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16楼2013-03-19 11:16:30
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dhmdddd at 2013-03-14 21:55:11
阅读框不会有问题吧?可以考虑把诱导的温度改变下,多做几个温度,我们实验室就遇到常用的表达条件不表达,(25℃,0.4mM IPTG),提高温度后就有目的蛋白了

请问一下你说的阅读框是目的基因的阅读框吧？在做原核表达的时候，我知道基因的CDS序列，怎么找它的阅读框尼？设计两端带有酶切位点的引物是根据阅读框设计吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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17楼2014-04-30 20:18:36
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