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jackhua17

禁虫 (小有名气)

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11楼2013-03-15 02:08:58
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zhanggu

银虫 (小有名气)

我用的也是pet-30a,插入2.3kb的基因,也没表达。
12楼2013-03-15 15:34:42
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qeotnd

新虫 (初入文坛)

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13楼2013-03-15 17:24:23
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田甜思

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by jackhua17 at 2013-03-15 02:08:58
PET-30 是有 N-terminal histag 吧。你加IPTG后induce 温度是多少?我一般20oC 12小时。再就是确信你的protein没有表达还是沉淀了。再就是来源比较远的基因不表达太正常不过了,查查其它类似基因表达的文献。

我都是在37度下培养6-8小时的
14楼2013-03-16 11:09:45
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Jathan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你可以降低一下温度,一般降低温度可能会促进重组蛋白的表达,另外IPTG对细菌本身具有一定毒性,建议多试几个浓度梯度,而且有时载体选择也会对你的蛋白表达起到一定影响,总之需要尝试,祝好运!
15楼2013-03-19 09:37:56
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1.是否有包涵体-如果有,降低IPTG含量,降低诱导温度
2.密码子是否优化(有否稀有密码子)-如果有,换菌株,如rosetta
3.有没有移码?
4.如果是表达量少,OD600到1再加IPTG,诱导时间和温度也要优化
16楼2013-03-19 11:16:30
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by dhmdddd at 2013-03-14 21:55:11
阅读框不会有问题吧?可以考虑把诱导的温度改变下,多做几个温度,我们实验室就遇到常用的表达条件不表达,(25℃,0.4mM IPTG),提高温度后就有目的蛋白了

请问一下你说的阅读框是目的基因的阅读框吧?在做原核表达的时候,我知道基因的CDS序列,怎么找它的阅读框尼?设计两端带有酶切位点的引物是根据阅读框设计吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
17楼2014-04-30 20:18:36
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