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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 全式金的表达载体pEASY-E2表达蛋白失败

谁用过全式金的表达载体pEASY-E2?我连接上了,测序正确,目的条带1000bp左右,用这个载体诱导表达,OD=0.4和OD 0.6都试了,IPTG浓度为0.8mM,诱导4h和过夜都试了,就是在诱导完的菌体总蛋白中没有看到明显的诱导后的目的带,而且我做了2个蛋白都这样,不知道为什么?有没有用过这个载体的大侠,请求分享经验,谢拉!
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
为何不用别的载体试试呢?如pET系列。如果你在重组蛋白表达上有困难的话,我们可以帮您解决。
静心做事。
2楼2013-03-05 08:17:46
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
weizhi111: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-05 23:25:30
反正构建载体也就是一部重组的问题,在下次构建载体时,可以构建一个只带GFP的载体,你可以根据菌体的颜色来确定你的蛋白表达量。方便你调整IPTG的浓度和遇到时间。

当然你也可以换其他载体试试,如PET系列的,这种载体一般实验室都有,你可以找同学借。
3楼2013-03-05 10:18:00
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-03-05 10:18:00
反正构建载体也就是一部重组的问题,在下次构建载体时,可以构建一个只带GFP的载体,你可以根据菌体的颜色来确定你的蛋白表达量。方便你调整IPTG的浓度和遇到时间。

当然你也可以换其他载体试试,如PET系列的,这 ...

谢谢,以前用过pet系列,觉得酶切连接总是做不好,所以这次想偷懒,用了全式金的载体,理论上和pet载体只是有酶切位点的区别(不需酶切),其他没什么区别,但就是没表达好,不知为什么。另外我想问下关于GFP构建,是单独在载体上连GFP,还是将GFP连接在目的基因的下游?
4楼2013-03-05 23:28:28
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yesali

木虫 (正式写手)

单独在载体上连GFP吧,连在基因下游有可能会对蛋白结构造成影响
5楼2013-03-06 08:49:21
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

送鲜花一朵
好的,谢谢。麻烦再问一下,一般做表达时稀有密码子要控制在什么范围内啊?我的序列长1300p,共30个稀有密码子?是不是太多了?而且有3个连在一起的
6楼2013-03-07 18:00:38
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ddtao

新虫 (小有名气)


7楼2016-04-02 12:51:25
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