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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 全式金的表达载体pEASY-E2表达蛋白失败
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 全式金的表达载体pEASY-E2表达蛋白失败

谁用过全式金的表达载体pEASY-E2？我连接上了，测序正确，目的条带1000bp左右，用这个载体诱导表达，OD=0.4和OD 0.6都试了，IPTG浓度为0.8mM，诱导4h和过夜都试了，就是在诱导完的菌体总蛋白中没有看到明显的诱导后的目的带，而且我做了2个蛋白都这样，不知道为什么？有没有用过这个载体的大侠，请求分享经验，谢拉！
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weizhi111

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1楼 2013-03-04 22:47:48
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为何不用别的载体试试呢？如pET系列。如果你在重组蛋白表达上有困难的话，我们可以帮您解决。
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静心做事。
2楼2013-03-05 08:17:46
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
weizhi111: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-05 23:25:30
反正构建载体也就是一部重组的问题，在下次构建载体时，可以构建一个只带GFP的载体，你可以根据菌体的颜色来确定你的蛋白表达量。方便你调整IPTG的浓度和遇到时间。

当然你也可以换其他载体试试，如PET系列的，这种载体一般实验室都有，你可以找同学借。
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3楼2013-03-05 10:18:00
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-03-05 10:18:00
反正构建载体也就是一部重组的问题，在下次构建载体时，可以构建一个只带GFP的载体，你可以根据菌体的颜色来确定你的蛋白表达量。方便你调整IPTG的浓度和遇到时间。

当然你也可以换其他载体试试，如PET系列的，这 ...

谢谢，以前用过pet系列，觉得酶切连接总是做不好，所以这次想偷懒，用了全式金的载体，理论上和pet载体只是有酶切位点的区别（不需酶切），其他没什么区别，但就是没表达好，不知为什么。另外我想问下关于GFP构建，是单独在载体上连GFP，还是将GFP连接在目的基因的下游？
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4楼2013-03-05 23:28:28
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yesali

木虫 (正式写手)
单独在载体上连GFP吧，连在基因下游有可能会对蛋白结构造成影响
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5楼2013-03-06 08:49:21
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
好的，谢谢。麻烦再问一下，一般做表达时稀有密码子要控制在什么范围内啊？我的序列长1300p，共30个稀有密码子？是不是太多了？而且有3个连在一起的
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6楼2013-03-07 18:00:38
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ddtao

新虫 (小有名气)
建议用Polycysteine-dendritic poly(His,Arg)1:5试一试
http://www.novel-polylysine.com/main/home/htm.php?nowmenuid=2
huiyisu@126.com
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7楼2016-04-02 12:51:25
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