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dearestff金虫 (小有名气)
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三种木质素降解酶酶活测定方法探讨 已有6人参与
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小弟正准备做木质素降解酶活测定，以前没接触过，看到文献中和论坛中测LiP、MnP和Lac酶活的方法很多而且不一，即使是用同一种底物，各溶液浓度和加入量也不统一，吸光度换算酶活公式等，很没头绪啊，希望能有一种统一可靠的三种酶活菜鸟级详细测定方法，欢迎各位虫友踊跃发言！小弟家底寒碜就不上金币了~在此奉上自己找的测定方法，请各位大神指导改正！ LiP： A：反应混合物 (4mL)含 2mmol L- 1藜芦醇、0.4 mmo l L- 1过氧化氢和50 mmol L- 1酒石酸-酒石酸钠缓冲溶液(pH =2.5)以及1mL粗酶液,用紫外分光光度计检测310nm处30 s/2.5min内吸光度值的变化. 定义每分钟氧化 1μmo l藜芦醇成藜芦醛所需的酶量为 1个酶活力单位。 B：取 0.2mL 藜芦醇溶液（10mmol•L-1）、0.4mL 酒石酸缓冲液（250mmol•L-1，pH=3.0）与 0.4mL 粗酶液混匀，即得 1mL 反应液。在 30℃下，于反应液中加 20μLH2O2溶液（20mmol•L-1）启动酶促反应，以未加启动因子的反应液为参比，用紫外分光光度计（UV-2550）测定 310nm 处 2min 前后反应液吸光度的变化。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生 1μmol藜芦醛所需的酶量 MnP： 反应混合物( 4 mL)含0.1 mmol L- 1硫酸锰、0 . 1 mmol L- 1过氧化氢和100 mmol L- 1酒石酸-酒石酸钠缓冲溶液 ( p H =5.0)以及 1mL粗酶液,用紫外分光光度计检测238nm处 10 s内吸光度值的变化。定义每分钟氧化 1μmol Mn2+为 Mn3+所需的酶量为 1个酶活力单位。 Lac： ABTS－分光光度计法：采用醋酸钠溶液作为缓冲溶液,在反应体系内的终浓度常为 0.02、0.05或0.10 mol /L , pH主要在4 ~ 5之间。反应体系内ABTS的浓度在 0.1 ~ 5 mmo l/L , 常用终浓度为0.5 mmo l/L。测定反应一般在室温下进行，ABTS经漆酶作用后形成ABTS自由基,在420 nm处ABTS自由基的吸光系数远大于底物ABTS, 随着ABTS自由基浓度的增加, 吸光度值变大,因此一般在420 nm处检测OD值的变化。 愈创木酚法：10 mL反应体系中, 含 50 mmol L- 1琥珀酸钠缓冲溶液(pH 值4. 5) , 0. 4 mmol L- 1的愈创木酚和0. 5 mL的酶液, 30℃条件下反应30 min 后, 于465 nm 处测OD 值.酶活力定义为: 以灭活的酶液反应混合物做对照, 1 min 内催化氧化1 nmoL 愈创木酚的酶量为1 U。 |
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