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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关在野生菌基础构建过表达细菌的问题
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Zedone

木虫 (正式写手)

[求助] 有关在野生菌基础构建过表达细菌的问题

小弟手上有一株降解细菌，革兰氏阴性，基因X是编码该细菌降解Y物质的还原酶的基因。前段时间一直有一个想法，想通过向该菌野生型导入携带基因X片段的表达质粒，使还原酶在野生型基础上表达量增加，以构建出高降解能力的菌株。(我先前在用该表达质粒回补X基因缺失菌株的时候，不仅恢复了功能，而且比野生型的降解能力稍微搞一些。)
     但是按照设想构建出来的菌株的降解能力不但没有提高，反而降低了。自己不知该如何解释这一奇怪的现象。前请各位大神能否帮忙解释和推测其原因，感激不尽。
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1楼 2013-01-12 21:41:23
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vgyhn
顶
2楼2013-01-12 22:21:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Zedone: 金币+5, ★★★很有帮助, 沉默子？能否讲的详细些呢 2013-01-13 22:19:49
silence掉了。一般做过表达的时候要把原来的野生拷贝敲掉，否则可能出问题。即使实现过表达，株系也不稳定。
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3楼2013-01-13 01:50:44
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55晴朗天天

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Zedone: 金币+5 2013-01-13 22:04:31
同行，同行~
我也正在做一株阴性降解菌，不过我的目标是降解基因，也是导入质粒，不过是没有影响的基因片段
就你的情况，基因的控制是微妙的，相互之间的影响也是不可预见的，一般构建高效菌 都是将高效基因 插入到容易生长的菌体中，这样构建的。
你知道这段基因，是吧，那你不如就把这段基因 导入简单的菌体中，比如E coli. 可以达到你的目的~
希望对你有帮助~
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有梦就有希望！想就有可能！
4楼2013-01-13 15:28:50
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Zedone

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 55晴朗天天 at 2013-01-13 15:28:50
同行，同行~
我也正在做一株阴性降解菌，不过我的目标是降解基因，也是导入质粒，不过是没有影响的基因片段
就你的情况，基因的控制是微妙的，相互之间的影响也是不可预见的，一般构建高效菌 都是将高效基因 插入 ...

E.coli 异原表达做过，没大的效果
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5楼2013-01-13 22:04:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
Zedone: 金币+10, 嗯，说的很详细。你所说的解决办法我做过的，也就是该基因的突变菌株回补实验。当时的效果是升高量不太明显，所以才决定这么做的。按照你的说法，我想可以在前面加个强启动子。3q 2013-01-14 11:00:23
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-13 01:50:44
silence掉了。一般做过表达的时候要把原来的野生拷贝敲掉，否则可能出问题。即使实现过表达，株系也不稳定。

你的这种情况是同源依赖性基因沉默。就是说你把另一个相同的基因拷贝转到宿主里后发现导入的和原有的拷贝都表达下降，甚至完全不表达。引起这个的原因可能有转录水平或者转录后水平的。转录水平的基因沉默与形成异染色质或者DNA甲基化有关。转录后沉默是mRNA形成后不稳定而不能形成正常的翻译产物。
当然，因为沉默的机理的复制性，过表达时候用野生背景也不一定发生沉默，有时候也能实现过表达。所以，为了避免沉默，过表达往往建在突变株的背景上。既然你的过表达株系发生了这个问题，解决你的问题的最简单的办法是如果你能把原来的拷贝敲除掉的话，用那个背景做过表达就没有问题了。
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6楼2013-01-14 02:50:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-14 02:50:30
你的这种情况是同源依赖性基因沉默。就是说你把另一个相同的基因拷贝转到宿主里后发现导入的和原有的拷贝都表达下降，甚至完全不表达。引起这个的原因可能有转录水平或者转录后水平的。转录水平的基因沉默与形成异 ...

回补实验一般用基因自身的启动子就可以了，也有人直接用强启动子。如果做过表达，就一定用强启动子了。
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7楼2013-01-14 15:20:07
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55晴朗天天

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by Zedone at 2013-01-13 22:04:21
E.coli 异原表达做过，没大的效果...

哦，那就不知道了，我用的是E.coli     感受态的  
那找找合适的质粒~
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有梦就有希望！想就有可能！
8楼2013-01-16 13:47:01
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