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液相分析方法建立的思路
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| 各位站友大家好，本人系药物分析菜鸟一只，目前正在积极学习中，很想知道建立一个液相分析方法（以反相色谱分析某一化学药物为例）具体的研究思路该是怎样，希望得到大家的指点，也欢迎大家在此热烈讨论，共同提高。 |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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我有一点点资料，希望对你有帮助。 HPLC分析方法开发与验证.pdf(238.79KB) http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DbHOdy7oUAQAa6d?p=130497 |
2楼2013-01-05 21:45:49
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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1有参考文献、标准的，看文献，如果峰不是很好，微调就行 2没有任何参考，完全未知 2.1先选择检测器，有紫外吸收的，需要先用紫外分光光度计做全波长扫描，尽量选择离200比较远的峰顶处 无紫外吸收的，可以用ELSD，RI，MS 2.2纯甲醇做流动相走一针，要求出峰后再走20min仍然无峰，最好是第一针走满1小时 根据这针的出峰大小，还可以判断进样量是否合适，是增加减少浓度还是体积等 2.3流动相中添加水，可以10%的比例加一次试试，出峰应该推迟，看看峰形以及分离度，峰形不好需要加酸碱盐，分离度不好还需要调整流动相比例 一般来说HPLC的影响因素是色谱柱，检测器，流动相，流速，柱温 色谱柱固定，检测器固定，基本就是调流动相，流动相有时甲醇不好会用乙腈代替，流速一般和色谱柱有关，基本都固定，适合微调。柱温在流动相实在无法改善的时候会调整，柱温低有利于前流份的分离，柱温高有利于后流份的分离。 色谱柱的选择大多数有机物C18都能分析，但要咨询色谱柱厂家，有的反相不适合高水相系统（超过85%的水）。现在一些聚合物的色谱柱也很流行，如分析糖的柱子，这些柱子对流动相和柱温的要求很高。 另外质谱检测器建议用窄径短柱，填料粒径细，耐受柱压高，分离效果好，流速低（0.3-0.5ml/min），质谱检测器耐0.5ml/min以下的流速，常规色谱柱（0.8-1ml/min）使用的话需要分流 ELSD，MS检测器的流动相不能含强酸强碱难挥发的盐，只能用甲酸乙酸氨水甲酸氨乙酸氨等 |
3楼2013-01-06 13:17:03
痴夷子皮
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【答案】应助回帖
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1、如果能有相关的文献或资料参考，估计会相对比较简单。 2、条件摸索 a、样品性质 主要了解化合物的结构、分子量、pKa、UV、样品浓度范围、溶解度等。 b、色谱柱选择 样品能溶于水-有机混合液的大多数样品（特别是中性或非离子化合物），可以选择反相HPLC，流动相选择水-有机溶剂，色谱柱可以选择C18、C8、TMS、苯基、氰基。一般C18用得比较多。 样品为离子或可电离的化合物（特别是碱性或阳离子样品），可以选择离子对HPLC，流动相选择水-有机溶剂，控制pH的缓冲液和离子对试剂，色谱柱可选择C18、C8、氰基。一般C18用得比较多。 若反相或离子对HPLC无效时，或样品不溶于水-有机混合液。可以选择正相HPLC体系。流动相选择有机溶剂混合液，色谱柱选择氰基、氨基、硅胶、二醇基。 c、初始分离条件（相对较好的首要选择、等度） 色谱柱：150X4.6mm、5um、固定相为C18或C8 流动相：缓冲液-乙腈，缓冲液可选择纯水或缓冲盐（浓度10~30mM）（若中性样品，无需使用缓冲盐）并用酸碱调控pH（如果pH小于2.5，建议选择pH稳定的色谱柱，避免固定相流失），乙腈起始比例可以选择80~100%。 离子对等添加剂，开始时请不要使用。流速1.0~2.0ml/min，柱温35~40℃。 样品：（最好以流动相溶解样品）进样体积小于25uL，进样量小于100ug。 d、液相方法基本目标 分离度：R大于1.5 分离时间：5~10min较理想 定量：RSD小于2% 压力：基本要求小于200bar（20M） 针对基本目标，按实际情况进行调整，譬如流动相实际组分比例，缓冲盐浓度及pH，柱温，梯度等。 |
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