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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[求助] DNA测序问题

最近在做重组子的构建,可是做完转化后,提取的质粒为什么浓度很低只有几十ng/ui,这个是什么原因跟跳的单克隆菌落的大小有关系吗?还有就是送去测序为什么得到的序列结果非常少只有三四百个bp,这是什么原因?希望大家能给宝贵意见,都做了三四个月了还是无结果,真的急疯了,谢谢各位了!!
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jasminezhao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-05 12:44:38
是什么载体?不同载体的复制子不一样,拷贝数也不同。此外,是不是抗生素失效了。如果抗生素压力小,质粒的拷贝数也上不去。还有,你的平板在4度放了很久吗?时间久了菌的活力下降,提质粒的时候浓度也上不去。至于 ...

用的是大肠杆菌,抗生素的浓度是200mg/ml,应该不能失效,平板方的时间也不是很长。还有就是你们一般测序是给公司提供的引物是用自己的还是用公司通用的?一般用一个还是两个?谢谢
15楼2013-01-07 09:00:36
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xingxingsf

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:24
做完转化的平板上长出的菌落是很小,所以要先划到新的平板上养一夜,长多点再提质粒,理论上即使挑很小的菌落在液体LB培养基里养一夜也能长到10的9次方左右了,足够提质粒了。你很少的原因可能是转化效率低,重组质粒没转进去?
测序一个反应就400bp左右,你的片段长的话可以要求公司测通,再拼接起来就行了。
2楼2013-01-04 21:13:43
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
浓度和你的质粒毒性/复制位点有关,低copy质粒就几十ng/ul,不过也够用了。

测序300-400是不是符合你预期的序列? 这个和质粒质量(杂质)/测序引物/质粒多少有关
3楼2013-01-05 03:42:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:36
你用的手提质粒还是盒子提?如果的低拷贝质粒,盒子提就是几十ng/ul。如果希望浓度高就多摇些菌。挑很小的克隆摇菌过夜提质粒也足够的。
高质量的测序一个反应可以读600-700nt,但是后面的分辨率也不是很好,400nt是正常的。当然,如果模板质量高,测序出来的结果会更漂亮,读出来的也稍微长一点。但也不会超过我说的那个数目了。如果你的序列长,需要多个引物测,再把序列拼接起来。
4楼2013-01-05 08:57:31
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