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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[求助] DNA测序问题

最近在做重组子的构建,可是做完转化后,提取的质粒为什么浓度很低只有几十ng/ui,这个是什么原因跟跳的单克隆菌落的大小有关系吗?还有就是送去测序为什么得到的序列结果非常少只有三四百个bp,这是什么原因?希望大家能给宝贵意见,都做了三四个月了还是无结果,真的急疯了,谢谢各位了!!
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dongrh1981

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by jasminezhao at 2013-01-05 09:23:00
我是用试剂盒提的,以前体的质粒浓度都是四五百,但是这两回都是几十,而且以前测序得到的结果是一千四五百个bp,但是这两回都是三四百个,所以我也不知道哪个是正确的了。求解答,谢谢!!...

测序返回的结果可能有1.4~1.5kb,但是能够清楚辨识并且有效和正确的序列一般只有700nt~800nt左右,一个测序反应一般有效读长只有700nt左右,这是业内公认的,也是目前应用sanger测序法仪器的性能极限。
呼吸的痛
11楼2013-01-06 11:29:52
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xingxingsf

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:24
做完转化的平板上长出的菌落是很小,所以要先划到新的平板上养一夜,长多点再提质粒,理论上即使挑很小的菌落在液体LB培养基里养一夜也能长到10的9次方左右了,足够提质粒了。你很少的原因可能是转化效率低,重组质粒没转进去?
测序一个反应就400bp左右,你的片段长的话可以要求公司测通,再拼接起来就行了。
2楼2013-01-04 21:13:43
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
浓度和你的质粒毒性/复制位点有关,低copy质粒就几十ng/ul,不过也够用了。

测序300-400是不是符合你预期的序列? 这个和质粒质量(杂质)/测序引物/质粒多少有关
3楼2013-01-05 03:42:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:36
你用的手提质粒还是盒子提?如果的低拷贝质粒,盒子提就是几十ng/ul。如果希望浓度高就多摇些菌。挑很小的克隆摇菌过夜提质粒也足够的。
高质量的测序一个反应可以读600-700nt,但是后面的分辨率也不是很好,400nt是正常的。当然,如果模板质量高,测序出来的结果会更漂亮,读出来的也稍微长一点。但也不会超过我说的那个数目了。如果你的序列长,需要多个引物测,再把序列拼接起来。
4楼2013-01-05 08:57:31
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