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关于原核表达问题 已有4人参与
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现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a 检测都合适了，现在想跑个sds–page 但不知道怎么做？ 要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？ 然后就离心取上清跑SDS–PAGE？ 还是怎么做？ 跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？ 最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？ 本人是一塌糊涂 请大家给予多多的意见和资料 谢谢 谢谢 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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12楼2013-05-22 06:54:59
snoopyzxx
木虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-30 18:55:57
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载体构建好了，鉴定没问题后，就转化表达菌啊，pET系列的要转化带DE3的表达菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用来表达pET28a载体。 如果已经转化了表达菌。那么可以挑克隆，进行小量诱导了。 具体方法就是： 1、挑克隆到试管中，比如20ml试管中装入5mlLB培养基，加相应的抗生素。过夜培养得到种子菌。 2、同样20ml试管中装5ml LB培养基，接入摇好的种子菌，接种量1%-5%。自己看着接就行了。 3、37℃，200-250rpm培养 4、OD600到0.6-0.8时，加入母液浓度为1M的IPTG，致终浓度0.1-1.0mM。第一次小诱可以加到终浓度1mM。 5、37度过夜诱导。16小时左右。 6、第二天取1ml菌液，离心，菌体沉淀用100ul 去离子水，或PBS或TRIS buffer重选，加loading buffer跑电泳。 7、如果确定有表达，就可以破菌鉴定可溶性了。 |
2楼2012-12-30 13:24:14
3楼2012-12-30 16:42:18
4楼2012-12-30 16:44:22
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