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yeyu541200

新虫 (小有名气)


[求助] 基因片段连接到载体中,偶很困难!!!!

我有一个荧光片段GFP,需要和另一个片段融合后,连接到Pcdna3.1载体中,我已经将GFP和我的目的片段融合了,就是将目地片段连接到PEGFP载体上。可是GFP+目的片段就是连不到3.1中去,换了酶切位点也不行,转化的时候要么不长,要么长一片,Amp换了又换,快把实验楼的其他实验室的Amp用过来了,浓度也是在变,哎    愁死我了,构建这个载体都一个月了,还没成功!请有经验的大侠帮帮忙!!!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-22 09:13:31
哎     昨天做了一遍又,连着两天 ,长得满满的,Amp浓度提高了2倍还是一样。愁死我了   现在都不知道哪家的Amp好使了。...

一般不是氨苄本身的问题。只是倒板的时候最好等培养基凉到50度左右再加抗生素。温度太高会使氨苄部分失效的。
7楼2012-12-22 11:47:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yeyu541200: 金币+1, 有帮助, 谢谢 2012-12-21 17:53:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2012-12-22 07:52:55
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗?有时候大片段的连接和转化不是很容易的。
2楼2012-12-21 13:17:39
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yeyu541200

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-21 13:17:39
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗?有时候大片段的连接和转化不是很容易的。

我的片段一共加起来才1400,很难么这样?
3楼2012-12-21 17:53:03
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keennes

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-12-22 07:52:20
yeyu541200: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-22 08:58:43
注意载体要酶切彻底,回收后定量;GFP+目的片段酶切后也定量;保证插入位点正确;酶连体系比例,插入片段摩尔数:载体摩尔数=5-10。祝顺利。
独上高楼,望尽天涯路……
4楼2012-12-22 00:48:24
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