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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因片段连接到载体中，偶很困难！！！！
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yeyu541200

新虫 (小有名气)

[求助] 基因片段连接到载体中，偶很困难！！！！

我有一个荧光片段GFP，需要和另一个片段融合后，连接到Pcdna3.1载体中，我已经将GFP和我的目的片段融合了，就是将目地片段连接到PEGFP载体上。可是GFP+目的片段就是连不到3.1中去，换了酶切位点也不行，转化的时候要么不长，要么长一片，Amp换了又换，快把实验楼的其他实验室的Amp用过来了，浓度也是在变，哎    愁死我了，构建这个载体都一个月了，还没成功！请有经验的大侠帮帮忙！！！
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1楼 2012-12-21 10:03:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yeyu541200: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2012-12-21 17:53:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2012-12-22 07:52:55
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗？有时候大片段的连接和转化不是很容易的。
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2楼2012-12-21 13:17:39
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yeyu541200

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-21 13:17:39
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗？有时候大片段的连接和转化不是很容易的。

我的片段一共加起来才1400，很难么这样？
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3楼2012-12-21 17:53:03
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keennes

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-12-22 07:52:20
yeyu541200: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-22 08:58:43
注意载体要酶切彻底，回收后定量；GFP+目的片段酶切后也定量；保证插入位点正确；酶连体系比例，插入片段摩尔数：载体摩尔数=5-10。祝顺利。
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独上高楼，望尽天涯路……
4楼2012-12-22 00:48:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yeyu541200: 金币+3, ★有帮助 2012-12-22 09:10:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-21 17:53:03
我的片段一共加起来才1400，很难么这样？...

1400bp不难的。有一次连4K的片段，弄了一个多月才出来的。
保证酶切完全。有的酶可能会切过，注意时间和用量。如果是单酶切的话把载体去5'P。祝实验顺利。
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5楼2012-12-22 07:41:02
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yeyu541200

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-22 07:41:02
1400bp不难的。有一次连4K的片段，弄了一个多月才出来的。
保证酶切完全。有的酶可能会切过，注意时间和用量。如果是单酶切的话把载体去5'P。祝实验顺利。...

哎     昨天做了一遍又，连着两天 ，长得满满的，Amp浓度提高了2倍还是一样。愁死我了   现在都不知道哪家的Amp好使了。
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6楼2012-12-22 09:13:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-22 09:13:31
哎     昨天做了一遍又，连着两天 ，长得满满的，Amp浓度提高了2倍还是一样。愁死我了   现在都不知道哪家的Amp好使了。...

一般不是氨苄本身的问题。只是倒板的时候最好等培养基凉到50度左右再加抗生素。温度太高会使氨苄部分失效的。
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7楼2012-12-22 11:47:46
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yeyu541200

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-22 11:47:46
一般不是氨苄本身的问题。只是倒板的时候最好等培养基凉到50度左右再加抗生素。温度太高会使氨苄部分失效的。...

哦    谢谢
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8楼2012-12-22 14:42:42
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zhangxihe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
yeyu541200: 金币+1 2012-12-26 20:02:56
长一片有影响么   你挑个单克隆就行了么
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9楼2012-12-26 18:30:37
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