应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因片段连接到载体中，偶很困难！！！！
91/1返回列表
查看: 1552  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yeyu541200

新虫 (小有名气)

[求助] 基因片段连接到载体中，偶很困难！！！！

我有一个荧光片段GFP，需要和另一个片段融合后，连接到Pcdna3.1载体中，我已经将GFP和我的目的片段融合了，就是将目地片段连接到PEGFP载体上。可是GFP+目的片段就是连不到3.1中去，换了酶切位点也不行，转化的时候要么不长，要么长一片，Amp换了又换，快把实验楼的其他实验室的Amp用过来了，浓度也是在变，哎    愁死我了，构建这个载体都一个月了，还没成功！请有经验的大侠帮帮忙！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-21 10:03:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yeyu541200: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2012-12-21 17:53:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2012-12-22 07:52:55
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗？有时候大片段的连接和转化不是很容易的。
赞一下 回复此楼
2楼2012-12-21 13:17:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeyu541200

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-21 13:17:39
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗？有时候大片段的连接和转化不是很容易的。

我的片段一共加起来才1400，很难么这样？
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-21 17:53:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

keennes

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-12-22 07:52:20
yeyu541200: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-22 08:58:43
注意载体要酶切彻底，回收后定量；GFP+目的片段酶切后也定量；保证插入位点正确；酶连体系比例，插入片段摩尔数：载体摩尔数=5-10。祝顺利。
赞一下 回复此楼
独上高楼，望尽天涯路……
4楼2012-12-22 00:48:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yeyu541200: 金币+3, ★有帮助 2012-12-22 09:10:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-21 17:53:03
我的片段一共加起来才1400，很难么这样？...

1400bp不难的。有一次连4K的片段，弄了一个多月才出来的。
保证酶切完全。有的酶可能会切过，注意时间和用量。如果是单酶切的话把载体去5'P。祝实验顺利。
赞一下 回复此楼
5楼2012-12-22 07:41:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeyu541200

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-22 07:41:02
1400bp不难的。有一次连4K的片段，弄了一个多月才出来的。
保证酶切完全。有的酶可能会切过，注意时间和用量。如果是单酶切的话把载体去5'P。祝实验顺利。...

哎     昨天做了一遍又，连着两天 ，长得满满的，Amp浓度提高了2倍还是一样。愁死我了   现在都不知道哪家的Amp好使了。
赞一下 回复此楼
6楼2012-12-22 09:13:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-22 09:13:31
哎     昨天做了一遍又，连着两天 ，长得满满的，Amp浓度提高了2倍还是一样。愁死我了   现在都不知道哪家的Amp好使了。...

一般不是氨苄本身的问题。只是倒板的时候最好等培养基凉到50度左右再加抗生素。温度太高会使氨苄部分失效的。
赞一下 回复此楼
7楼2012-12-22 11:47:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeyu541200

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-22 11:47:46
一般不是氨苄本身的问题。只是倒板的时候最好等培养基凉到50度左右再加抗生素。温度太高会使氨苄部分失效的。...

哦    谢谢
回复此楼
8楼2012-12-22 14:42:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangxihe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
yeyu541200: 金币+1 2012-12-26 20:02:56
长一片有影响么   你挑个单克隆就行了么
赞一下 回复此楼
9楼2012-12-26 18:30:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yeyu541200 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭