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yeyu541200

新虫 (小有名气)


[求助] 基因片段连接到载体中,偶很困难!!!!

我有一个荧光片段GFP,需要和另一个片段融合后,连接到Pcdna3.1载体中,我已经将GFP和我的目的片段融合了,就是将目地片段连接到PEGFP载体上。可是GFP+目的片段就是连不到3.1中去,换了酶切位点也不行,转化的时候要么不长,要么长一片,Amp换了又换,快把实验楼的其他实验室的Amp用过来了,浓度也是在变,哎    愁死我了,构建这个载体都一个月了,还没成功!请有经验的大侠帮帮忙!!!
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keennes

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-12-22 07:52:20
yeyu541200: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-22 08:58:43
注意载体要酶切彻底,回收后定量;GFP+目的片段酶切后也定量;保证插入位点正确;酶连体系比例,插入片段摩尔数:载体摩尔数=5-10。祝顺利。
独上高楼,望尽天涯路……
4楼2012-12-22 00:48:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yeyu541200: 金币+1, 有帮助, 谢谢 2012-12-21 17:53:49
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2012-12-22 07:52:55
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗?有时候大片段的连接和转化不是很容易的。
2楼2012-12-21 13:17:39
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yeyu541200

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-21 13:17:39
转化的时候什么都不长至少是说那批板子上的Amp是有效的吧。
你的GFP+目的片段合起来很大吗?有时候大片段的连接和转化不是很容易的。

我的片段一共加起来才1400,很难么这样?
3楼2012-12-21 17:53:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yeyu541200: 金币+3, 有帮助 2012-12-22 09:10:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by yeyu541200 at 2012-12-21 17:53:03
我的片段一共加起来才1400,很难么这样?...

1400bp不难的。有一次连4K的片段,弄了一个多月才出来的。
保证酶切完全。有的酶可能会切过,注意时间和用量。如果是单酶切的话把载体去5'P。祝实验顺利。
5楼2012-12-22 07:41:02
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