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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于平末端连接
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于平末端连接 已有3人参与

大家好！我最近在做平末端连接的实验，总是做不成功，求教~~
     载体是用smal1酶切的平末端，片段是双酶切的粘性末端，酶切后，载体进行去磷酸化，片段进行末端补平，然后进行连接反应（16℃过夜），然后转化，平板上都不长菌。。。。
   一开始载体是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑电泳后发现，载体只是部分被切开了，然后酶切时间就改成了过夜，结果都切没了，，，
   所有的酶都用的是Takara公司的。

   求高人指点啊！！！谢谢啦O(∩_∩)O~
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1楼 2012-12-18 10:31:31
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 那雨那女孩 at 2016-01-15 18:08:06
就是用平末端连接后，目的基因和载体之间会不会多出来的碱基（除了补平，会不会多加碱基），平末端连接是不定向的吗？之后该怎么筛选？大神...

筛选只能是测序。你也可以在目的片段的正向引物上加酶切位点XHOL1,然后用质粒上的酶切位点nde1。双酶切后
————nde1————XHOL                                                        正向连入就只能切出10几BP。                                          

————nde1————————————————————XHOL    反向连入就能切出和目的片段一样大小的序列。
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采菊东篱下，悠然见南山。
15楼2017-05-04 15:21:40
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:41
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。
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2楼2012-12-18 12:23:31
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:23:31
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。

谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败
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3楼2012-12-21 16:15:17
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuwei0824 at 2012-12-21 16:15:17
谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败...

粘性末端补平应该是用聚合酶孵化，而聚合酶大多是有方向性的，如果是3’粘性末端，好像是不行的，当然也要看你用的是什么聚合酶。
我刚查了一下，SacI是3‘粘性末端，你做不出结果，问题可能在这。
建议你还是换个酶切位点。
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4楼2012-12-24 12:35:12
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