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lxh502976898

金虫 (小有名气)

[交流] 亲和层析 已有4人参与

如何提高亲和柱子的吸附 我想提高一下带组氨酸标签的目的蛋白的吸附
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1楼 2012-11-26 14:44:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hzlatqh

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-11-26 16:32:04
不懂 滚一边去 上亲和柱子 就是为了除杂蛋白 我说的是提高目的蛋白的吸附 降低杂蛋白的挂柱吸附...

提高binding buffer中咪唑的浓度可以减少杂蛋白的吸附，增加目标蛋白吸附的特异性。当然得保证目标蛋白在该条件下能吸附得上。。。实在不行可增加histag的长度，提高和柱子的结合力。。。
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两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天
5楼2012-11-26 23:48:50
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匆匆3016

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以尝试下改变以pH或者盐的浓度，看看有没有效果
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go ahead show your wild side
9楼2012-11-27 11:14:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-11-27 11:07:40
我的目的蛋白现在20mM咪唑的结合液洗杂蛋白时，目的蛋白也洗来了，10mM能全部挂上柱，但是在7万（目的蛋白10000）那有杂带，如何让我的蛋白和柱子结合牢一点，超过20mM也不会不我的蛋白洗下来，洗脱时可以分阶段， ...

20mM一般是能洗下来少许His-tagged蛋白，不过要看你的目的了。一般是希望得到更纯的产物，损失一点产物也没什么太大关系吧。如果你觉得用20mM咪唑下来的目的蛋白太多，可以在binding buffer里面直接加15mM咪唑，样品也是，然后用15mM咪唑洗，多洗（10-15柱身体积）能够尽量把非特异结合的去掉，然后再用高浓度咪唑elute，收集。
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10楼2012-11-27 11:51:07
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普通回帖

dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
降低杂蛋白的含量就行了，哈哈哈
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2楼2012-11-26 15:35:05
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-11-26 15:35:05
降低杂蛋白的含量就行了，哈哈哈

不懂 滚一边去 上亲和柱子 就是为了除杂蛋白 我说的是提高目的蛋白的吸附 降低杂蛋白的挂柱吸附
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3楼2012-11-26 16:32:04
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-11-26 16:32:04
不懂 滚一边去 上亲和柱子 就是为了除杂蛋白 我说的是提高目的蛋白的吸附 降低杂蛋白的挂柱吸附...

你怎么骂人呢？
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4楼2012-11-26 17:04:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
上样品前最好用binding buffer, wash buffer, elute buffer先上一下柱子，这样可以减少柱子的非特异性吸附，防止做完实验后很多东西还挂在柱子上。样品中加入低浓度咪唑（10-15mM）也可以减少非特异性吸附。如果样品中目的蛋白含量不是很高，可以让样品多上几次柱后再wahing，增加吸附。
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6楼2012-11-27 07:40:14
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-11-26 17:04:16
你怎么骂人呢？...

我不是骂人 你回的帖子 没有经过脑子思考 纯化是什么?你告诉我如何降低杂蛋白？如果可行 大家走什么亲和柱子啊
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7楼2012-11-27 10:44:34
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-27 07:40:14
上样品前最好用binding buffer, wash buffer, elute buffer先上一下柱子，这样可以减少柱子的非特异性吸附，防止做完实验后很多东西还挂在柱子上。样品中加入低浓度咪唑（10-15mM）也可以减少非特异性吸附。如果样品 ...

我的目的蛋白现在20mM咪唑的结合液洗杂蛋白时，目的蛋白也洗来了，10mM能全部挂上柱，但是在7万（目的蛋白10000）那有杂带，如何让我的蛋白和柱子结合牢一点，超过20mM也不会不我的蛋白洗下来，洗脱时可以分阶段，在几个低阶段把杂蛋白先洗下来，高咪唑才把我的蛋白洗下来。
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8楼2012-11-27 11:07:40
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