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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为何CTAB法提取的DNA总是断裂？
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-29 05:13:54
DNA要降解也不容易啊，估计就是RNA没除干净

可是加了RNA酶之后，DNA 都跑不出条带啊！
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haha
31楼2012-11-29 09:28:25
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
30楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-29 09:27:20
不知道，今天跑了电泳，没有条带！郁闷啊！...

增加一下你的样品量试试，每次都这样吗？
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32楼2012-11-29 11:32:57
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-29 11:32:57
增加一下你的样品量试试，每次都这样吗？...

没有，之前都没有加RNA酶，我的上样量是6ul,一点迹象都没有！
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haha
33楼2012-11-29 12:58:18
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得你这个很奇怪，应该不会加了RNase就消化没了，有点离谱，我从来没遇到过这种情况，你检查一下试剂或步骤吧，或者看看实验室其他人做的如何
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34楼2012-11-29 13:56:06
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
33楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-29 12:58:18
没有，之前都没有加RNA酶，我的上样量是6ul,一点迹象都没有！...

我们今天刚第一次提取 跑胶15min 迁移速率很小 条带非常亮 而且最下面根本没有常见的RNA“弥散条带”
估计你方法有问题 都把RNA提出来了 DNA那么大跑胶是应该很慢慢的吧
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
35楼2012-11-30 17:09:08
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 看天 at 2012-11-30 17:09:08
我们今天刚第一次提取 跑胶15min 迁移速率很小 条带非常亮 而且最下面根本没有常见的RNA“弥散条带”
估计你方法有问题 都把RNA提出来了 DNA那么大跑胶是应该很慢慢的吧...

1，称0.2-0.5g叶于预冷的研钵中快速研磨（研磨中加有10mg左右的PVP），研细后加入1ml的提取缓冲液（100mmol/l Tris-Hcl,50mmol/ledta,700mmol/lNacl,2%巯基乙醇，2%PVP）摇匀，在冰上静置10min.
2,取出离心管5000r/min 10min,去上清，加1ml预热的裂解缓冲液（100mmol/l Tris-Hcl,20mmol/ledta,1.4mol/lNacl,2%巯基乙醇,2%PVP,4%CTAB）混匀，于65度水浴锅中水浴1h,期间轻轻颠倒混匀数次。
3，取出离心管冷却至室温，12000r/mim 10min离心。
4，将上清转入新的离心管中加等体积的氯仿/异戊醇混匀，12000r/mim 10min离心。
5，去上清加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀，12000r/mim 10min离心。
6，将上清转入新的离心管中加等体积的氯仿/异戊醇混匀，12000r/mim 10min离心。
7，取上清，加入100ul5mol/lNacl,再加2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。放入-20度冰箱静止30min后，12000r/mim 10min离心。
8，沉淀用70%，及无水乙醇各洗两次，各10min 左右。
9，风干后加TE溶解,加0.5ml(0.5ulRNA酶)的TE溶解，55度放置1h,加入等体积的氯仿/异戊醇抽提1次，12000r/min,10min,再加1/3体积异丙醇及2倍体积无水乙醇（均预冷）沉淀-20度放置30min看不到沉淀，12000r/min离心后还是没有
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haha
36楼2012-11-30 17:26:33
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看天

木虫 (知名作家)
我今天也在查关于总DNA提取的东西 我看有好些虫子说即使跑胶没条带也可以P出来 可能加RNA酶吧RNA降解了 DNA又很少所以电泳跑胶看不出 你不妨P试试
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
37楼2012-11-30 18:37:18
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tengwan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
36楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-30 17:26:33
1，称0.2-0.5g叶于预冷的研钵中快速研磨（研磨中加有10mg左右的PVP），研细后加入1ml的提取缓冲液（100mmol/l Tris-Hcl,50mmol/ledta,700mmol/lNacl,2%巯基乙醇，2%PVP）摇匀，在冰上静置10min.
2,取出离心管500 ...

第7步，为啥还加NaCl？这一步的目的为沉淀DNA
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38楼2013-04-26 16:30:18
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笑西少

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感觉LZ是研磨的时候应该用液氮，冰上研磨，DNA很容易降解掉吧
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天然产物化学
39楼2015-02-18 02:37:55
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羿秋轩主人

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-27 09:21:17
有时是新采的，有时是在-20度保持一天或两天的《不过一直都是用的成熟叶片，因为现在没有嫩叶！...

提基因组哪用那么麻烦搞新鲜样本，不是这个事情。我个人比较认同前面一个同学说的是RNA没除去。
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40楼2015-02-18 15:00:25
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