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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

引用回帖:
29楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-29 05:13:54
DNA要降解也不容易啊,估计就是RNA没除干净

可是加了RNA酶之后,DNA 都跑不出条带啊!
haha
31楼2012-11-29 09:28:25
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

引用回帖:
30楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-29 09:27:20
不知道,今天跑了电泳,没有条带!郁闷啊!...

增加一下你的样品量试试,每次都这样吗?
32楼2012-11-29 11:32:57
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

引用回帖:
32楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-29 11:32:57
增加一下你的样品量试试,每次都这样吗?...

没有,之前都没有加RNA酶,我的上样量是6ul,一点迹象都没有!
haha
33楼2012-11-29 12:58:18
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

我觉得你这个很奇怪,应该不会加了RNase就消化没了,有点离谱,我从来没遇到过这种情况,你检查一下试剂或步骤吧,或者看看实验室其他人做的如何
34楼2012-11-29 13:56:06
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看天

木虫 (知名作家)

引用回帖:
33楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-29 12:58:18
没有,之前都没有加RNA酶,我的上样量是6ul,一点迹象都没有!...

我们今天刚第一次提取 跑胶15min 迁移速率很小 条带非常亮 而且最下面根本没有常见的RNA“弥散条带”
估计你方法有问题 都把RNA提出来了 DNA那么大跑胶是应该很慢慢的吧
戒嗔怒以养肝气,省言语以养神气,多读书以养质气,顺时令以养元气,不拘节以养大气,观天变以养灵气,莫强求规于运气。
35楼2012-11-30 17:09:08
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

引用回帖:
35楼: Originally posted by 看天 at 2012-11-30 17:09:08
我们今天刚第一次提取 跑胶15min 迁移速率很小 条带非常亮 而且最下面根本没有常见的RNA“弥散条带”
估计你方法有问题 都把RNA提出来了 DNA那么大跑胶是应该很慢慢的吧...

1,称0.2-0.5g叶于预冷的研钵中快速研磨(研磨中加有10mg左右的PVP),研细后加入1ml的提取缓冲液(100mmol/l Tris-Hcl,50mmol/ledta,700mmol/lNacl,2%巯基乙醇,2%PVP)摇匀,在冰上静置10min.
2,取出离心管5000r/min 10min,去上清,加1ml预热的裂解缓冲液(100mmol/l Tris-Hcl,20mmol/ledta,1.4mol/lNacl,2%巯基乙醇,2%PVP,4%CTAB)混匀,于65度水浴锅中水浴1h,期间轻轻颠倒混匀数次。
3,取出离心管冷却至室温,12000r/mim 10min离心。
4,将上清转入新的离心管中加等体积的氯仿/异戊醇混匀,12000r/mim 10min离心。
5,去上清加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,12000r/mim 10min离心。
6,将上清转入新的离心管中加等体积的氯仿/异戊醇混匀,12000r/mim 10min离心。
7,取上清,加入100ul5mol/lNacl,再加2倍体积预冷的无水乙醇,颠倒混匀。放入-20度冰箱静止30min后,12000r/mim 10min离心。
8,沉淀用70%,及无水乙醇各洗两次,各10min 左右。
9,风干后加TE溶解,加0.5ml(0.5ulRNA酶)的TE溶解,55度放置1h,加入等体积的氯仿/异戊醇抽提1次,12000r/min,10min,再加1/3体积异丙醇及2倍体积无水乙醇(均预冷)沉淀-20度放置30min看不到沉淀,12000r/min离心后还是没有
haha
36楼2012-11-30 17:26:33
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看天

木虫 (知名作家)

我今天也在查关于总DNA提取的东西 我看有好些虫子说即使跑胶没条带也可以P出来 可能加RNA酶吧RNA降解了 DNA又很少所以电泳跑胶看不出 你不妨P试试
戒嗔怒以养肝气,省言语以养神气,多读书以养质气,顺时令以养元气,不拘节以养大气,观天变以养灵气,莫强求规于运气。
37楼2012-11-30 18:37:18
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tengwan

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
36楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-30 17:26:33
1,称0.2-0.5g叶于预冷的研钵中快速研磨(研磨中加有10mg左右的PVP),研细后加入1ml的提取缓冲液(100mmol/l Tris-Hcl,50mmol/ledta,700mmol/lNacl,2%巯基乙醇,2%PVP)摇匀,在冰上静置10min.
2,取出离心管500 ...

第7步,为啥还加NaCl?这一步的目的为沉淀DNA
38楼2013-04-26 16:30:18
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笑西少

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感觉LZ是研磨的时候应该用液氮,冰上研磨,DNA很容易降解掉吧
天然产物化学
39楼2015-02-18 02:37:55
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羿秋轩主人

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 下雨的傍晚 at 2012-11-27 09:21:17
有时是新采的,有时是在-20度保持一天或两天的《不过一直都是用的成熟叶片,因为现在没有嫩叶!...

提基因组哪用那么麻烦搞新鲜样本,不是这个事情。我个人比较认同前面一个同学说的是RNA没除去。
40楼2015-02-18 15:00:25
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