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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为何CTAB法提取的DNA总是断裂？
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

[求助] 为何CTAB法提取的DNA总是断裂？ 已有1人参与

最近一直提取的植物总DNA总是断裂，使用的是自己配制的溶液，用改良的CTAB法，提取过程已经很小心了，没有剧烈震荡，可是总是提到断裂的DNA 是什么原因呢？下图是我提的DNA 跑的0.8%琼脂糖凝胶电泳！急希望各位虫虫帮忙解答！

IMG_20121123_103631.jpg
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haha
1楼 2012-11-24 17:12:10
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 看天 at 2012-11-30 17:09:08
我们今天刚第一次提取 跑胶15min 迁移速率很小 条带非常亮 而且最下面根本没有常见的RNA“弥散条带”
估计你方法有问题 都把RNA提出来了 DNA那么大跑胶是应该很慢慢的吧...

1，称0.2-0.5g叶于预冷的研钵中快速研磨（研磨中加有10mg左右的PVP），研细后加入1ml的提取缓冲液（100mmol/l Tris-Hcl,50mmol/ledta,700mmol/lNacl,2%巯基乙醇，2%PVP）摇匀，在冰上静置10min.
2,取出离心管5000r/min 10min,去上清，加1ml预热的裂解缓冲液（100mmol/l Tris-Hcl,20mmol/ledta,1.4mol/lNacl,2%巯基乙醇,2%PVP,4%CTAB）混匀，于65度水浴锅中水浴1h,期间轻轻颠倒混匀数次。
3，取出离心管冷却至室温，12000r/mim 10min离心。
4，将上清转入新的离心管中加等体积的氯仿/异戊醇混匀，12000r/mim 10min离心。
5，去上清加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀，12000r/mim 10min离心。
6，将上清转入新的离心管中加等体积的氯仿/异戊醇混匀，12000r/mim 10min离心。
7，取上清，加入100ul5mol/lNacl,再加2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。放入-20度冰箱静止30min后，12000r/mim 10min离心。
8，沉淀用70%，及无水乙醇各洗两次，各10min 左右。
9，风干后加TE溶解,加0.5ml(0.5ulRNA酶)的TE溶解，55度放置1h,加入等体积的氯仿/异戊醇抽提1次，12000r/min,10min,再加1/3体积异丙醇及2倍体积无水乙醇（均预冷）沉淀-20度放置30min看不到沉淀，12000r/min离心后还是没有
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haha
36楼2012-11-30 17:26:33
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
??是ＤＮＡ断裂，是????大，ＲＮＡ没消化，太多了。上???是ＤＮＡ，下???分??????的2-3???带是ＲＮＡ，用ＲＮase消化一下就??会有了。???外，ＤＮＡ沉淀???，4000-6000rpm离心??????。
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2楼2012-11-24 20:48:19
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不是DNA断裂，是RNA没消化。上面的一条带是DNA，下面2-3条带是RNA，RNase消化一下就没有了。另外DNA沉淀后用4000-6000rpm离心就可以了。
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下雨的傍晚
3楼2012-11-24 20:52:44
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by shuishui007 at 2012-11-24 20:52:44
不是DNA断裂，是RNA没消化。上面的一条带是DNA，下面2-3条带是RNA，RNase消化一下就没有了。另外DNA沉淀后用4000-6000rpm离心就可以了。

谢谢，那我加RNA酶是一下！
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haha
4楼2012-11-25 14:12:31
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