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leannele

金虫 (小有名气)

[交流] 关于用于q-PCR的RNA模板浓度测定 已有2人参与

本人是做植物病毒病的。最近用q-PCR检测样本中病毒的表达量。提取RNA后测定浓度,然后取1微克总RNA做反转录,然后做q-PCR。
    我的样本比较少,不能大量提取RNA,在RNA提出来后不可能用抽提法去除基因组DNA,只能使用公司的试剂盒。
    困惑的是我应该是在取出基因组DNA前测定RNA的浓度还是去除之后测定,或者是在其前后都测定?因为加入的DNA酶是要根据RNA的浓度来计算的。
还请各位帮忙
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zhoulubin

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
第一、建议你先跑电泳看看DNA残留情况,很多RNA提取试剂盒提不出DNA的;
第二、没必要纠结在上面时候测浓度,引物反转录说的1微克只是上限;
第三、如果你做Qpcr用的是dealt dealt Ct法,就没必要保证cDNA浓度一致,因为你有内参;
第四、如果是我,我会在反转录之后,再用cDNA跑个Act,电泳就知道大概各样品的浓度,好知道QPCR时稀释模板。
每个年龄都有其最应该做的事,但只有过了那个年龄自己才知道
2楼2012-11-15 20:35:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
最好是粗测一下提RNA浓度,根据这个做DNase消化,消化后再精确定浓度,反转录的RNA用量要根据消化过DNA的RNA浓度来做。
3楼2012-11-16 09:23:51
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