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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大唱杆菌JM109表达我的重组菌，无法表达怎么办
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)

[求助] 大唱杆菌JM109表达我的重组菌，无法表达怎么办

请问，我将含有tac启动子的重组菌转到大肠杆菌JM109中，测了很多次的SDS-PAGE就是看不到目的条带。是不是tac启动子在JM109中不能表达？还是我用IPTG诱导的温度37度不合适？或者更糟糕的说，是之前的构建有问题。但是自己反复想，就是想不出来那里出问题了。请大家帮忙想想办法哦！谢谢啦！
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1楼 2012-11-14 10:36:19
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-14 16:37:40
JM109是克隆宿主菌，表达蛋白的话应该用表达宿主菌，例如BL21，rosetter等，详细的可以自己百度一下。
另外你用的载体，是否适合表达，还是只是克隆载体，这些都有区别的。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
2楼2012-11-14 13:43:52
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求助还搞那么多错别字，态度也忒那个啥了吧
另，这么业余的错误也能犯，也忒不认真了，好好学习2楼的指导吧
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3楼2012-11-14 13:54:17
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-14 13:43:52
JM109是克隆宿主菌，表达蛋白的话应该用表达宿主菌，例如BL21，rosetter等，详细的可以自己百度一下。
另外你用的载体，是否适合表达，还是只是克隆载体，这些都有区别的。

先谢谢你！关于这个问题，我也问过师兄，他说JM109可以表达连接tac启动子的重组菌。我选用了两种载体，PUC19和pEtac,不过都选用的启动子是tac启动子，现在的情况是，两种载体都没有表达。所以....不知道该怎么办了。
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4楼2012-11-14 16:39:46
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-14 13:54:17
求助还搞那么多错别字，态度也忒那个啥了吧
另，这么业余的错误也能犯，也忒不认真了，好好学习2楼的指导吧

谢谢楼上的批评，不过这些问题我都有考虑到，但是却无法表达。
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5楼2012-11-14 16:40:51
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

蛋白有胞内、胞外分泌的，你都看了吗？另，你加诱导了吗？如果这些都做了，还是没蛋白条带，建议你提RNA，反转录cDNA,然后以此为模板做PCR，看看有没有条带，即验证基因有没有转录。如果还没有，洗洗睡吧
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6楼2012-11-16 13:27:32
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

如果确定你的载体及宿主都是能表达tac的话，那就只好换诱导条件了
另外不同的宿主诱导的效果不一样，所以也可以换不同的宿主试试。
如果实在都不行，就没办法了，蛋白表达也是很诡异的事情
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你的日子如何，你的力量也必如何！
7楼2012-11-16 13:45:13
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-16 13:27:32
蛋白有胞内、胞外分泌的，你都看了吗？另，你加诱导了吗？如果这些都做了，还是没蛋白条带，建议你提RNA，反转录cDNA,然后以此为模板做PCR，看看有没有条带，即验证基因有没有转录。如果还没有，洗洗睡吧

胞内，胞外都做SDS-PAGE了。诱导肯定加了。我想改变一下诱导条件再试试。谢谢！
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8楼2012-11-16 14:39:43
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-16 13:45:13
如果确定你的载体及宿主都是能表达tac的话，那就只好换诱导条件了
另外不同的宿主诱导的效果不一样，所以也可以换不同的宿主试试。
如果实在都不行，就没办法了，蛋白表达也是很诡异的事情

嗯，我也是这么想的，今天改变条件再诱导一下，看看。谢谢各位的建议！
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9楼2012-11-16 14:40:27
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实在不行还是换专门的表达菌株例如C41，BL21之类的吧~同时也换成pET系列载体来表达，还能带tag呢~
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10楼2012-11-16 16:19:26
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