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woshi212

金虫 (小有名气)

[求助] 请教大家一下，酵母发酵体系下，如何提取NADH和NAD+，还有就是测定方法是什么，求助啊

如题，正在做酵母发酵体系，想在代谢过程中监测辅酶NADH和NAD+的含量，求提取方法，以及使用HPLC如何准确建立测试方法啊，可以推荐文献也可以哈，可以加金币的，刚玩不久，请原谅
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nothing！！！
1楼 2012-11-14 09:48:19
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woshi212

金虫 (小有名气)
希望大家，给点意见，很着急，我是新手
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nothing！！！
2楼2012-11-14 09:48:43
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看天

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
woshi212: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-16 16:19:26
我们用 enzyme cyclying assay的时候提取：取样离心后加0.2mNaOH 50摄氏度水浴10min用于提取NAD(P)H ；若提取NAD(P)用HCl就好了，后续分析时在用0.1m的酸或碱小心地调回来；
有写用TCA（三氯乙酸）萃取的 然后做HPLC分析 你可以查一下文献
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
3楼2012-11-14 14:34:51
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woshi212

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 看天 at 2012-11-14 14:34:51
我们用 enzyme cyclying assay的时候提取：取样离心后加0.2mNaOH 50摄氏度水浴10min用于提取NAD(P)H ；若提取NAD(P)用HCl就好了，后续分析时在用0.1m的酸或碱小心地调回来；
有写用TCA（三氯乙酸）萃取的 然后做HP ...

你是用酶循环法的吧，这方法是否可以区分NADH和NADPH，我是想做液相，但是我不知这个提取方法是否可以直接使用到液相中，会不会因为盐离子浓度高二伤害柱子，还有就是非常谢谢你，请问酶循环法效果怎么样？
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nothing！！！
4楼2012-11-15 11:16:54
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by woshi212 at 2012-11-15 11:16:54
你是用酶循环法的吧，这方法是否可以区分NADH和NADPH，我是想做液相，但是我不知这个提取方法是否可以直接使用到液相中，会不会因为盐离子浓度高二伤害柱子，还有就是非常谢谢你，请问酶循环法效果怎么样？...

酶循环测NAD(H)还行，测NADP（H）重复性很差 且对试剂要求高
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
5楼2012-11-15 17:16:34
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suliqiu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 看天 at 2012-11-14 14:34:51
我们用 enzyme cyclying assay的时候提取：取样离心后加0.2mNaOH 50摄氏度水浴10min用于提取NAD(P)H ；若提取NAD(P)用HCl就好了，后续分析时在用0.1m的酸或碱小心地调回来；
有写用TCA（三氯乙酸）萃取的 然后做HP ...

想请问一下，您用酶循环法测辅酶NAD(H)，提取NAD(H)时添加Hcl或NaOH的量是怎么确定的？
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6楼2013-12-12 10:55:18
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by suliqiu at 2013-12-12 10:55:18
想请问一下，您用酶循环法测辅酶NAD(H)，提取NAD(H)时添加Hcl或NaOH的量是怎么确定的？...

我是2ml菌体离心加500ul 0.2M的NaOH提取之后再加等体积的0.1MHCl回调
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
7楼2013-12-13 10:36:05
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suliqiu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 看天 at 2013-12-13 10:36:05
我是2ml菌体离心加500ul 0.2M的NaOH提取之后再加等体积的0.1MHCl回调...

恩，知道了，您用的是细菌吧，咱差不多~谢谢哈~这下心里有底了~
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8楼2013-12-13 11:24:52
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by suliqiu at 2013-12-13 11:24:52
恩，知道了，您用的是细菌吧，咱差不多~谢谢哈~这下心里有底了~...

是的是革兰氏阳性细菌 你的热提取条件如何
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
9楼2013-12-14 13:40:03
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suliqiu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 看天 at 2013-12-14 13:40:03
是的是革兰氏阳性细菌 你的热提取条件如何...

我的也是革兰氏阳性菌，我用的是1ml菌体离心，加300μ 0.2M的Nacl或HCL.你对方法进行验证了吗，例如回收率实验~
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10楼2013-12-15 14:15:06
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