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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 跑荧光定量PCR，目的基因都是NA，内参基因均跑出来了，请问是怎么回事？
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ddf273634096

新虫 (小有名气)

[求助] 跑荧光定量PCR，目的基因都是NA，内参基因均跑出来了，请问是怎么回事？

测的是水稻分蘖芽中的OSTB1，MOC1这2个目的基因，内参选的Actin。用的百乐的荧光定量机子。
第一次跑的OSTB1基因，CT值在28左右，同一重复内部三管的重复性还不错。
后面跑MOC1基因时，CT值是NA？请问是怎么回事？
引物均是来自文献。

OSTB1.jpg



MOC1.jpg
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1楼 2012-11-10 17:20:06
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ddf273634096

新虫 (小有名气)
额，第二张图传错了，就是目标基因有的值是NA，请问怎么回事？
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2楼2012-11-10 17:23:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是MOC1在你测的组织的生长条件下丰度低，可以尝试适当增加做qPCR时cDNA的用量。实在不行的话可以在做反转录的时候加入3’引物。
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3楼2012-11-11 02:12:15
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
cDNA浓度太低，你最好控制CP值15-25之间，否则数据有效性影响较大。
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4楼2012-11-11 11:07:25
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-12 14:31:45
本身表达量太低。。。
还有，你确定下你的这个组织中确实表达这个基因吧。。。建议先做个普通PCR,看看表达不吧。。。
都不表达了，你这个差异也是没意义的了。或者，你可以找个表达这个基因的组织，做个对照，看看。
还有，引物没忘记加吧，，，，哈哈
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5楼2012-11-11 11:14:42
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

本身表达量太低。。。
还有，你确定下你的这个组织中确实表达这个基因吧。。。建议先做个普通PCR,看看表达不吧。。。
都不表达了，你这个差异也是没意义的了。或者，你可以找个表达这个基因的组织，做个对照，看看。
还有，引物没忘记加吧，，，，哈哈
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6楼2012-11-11 11:17:16
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ddf273634096

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-11-11 11:17:16
本身表达量太低。。。
还有，你确定下你的这个组织中确实表达这个基因吧。。。建议先做个普通PCR,看看表达不吧。。。
都不表达了，你这个差异也是没意义的了。或者，你可以找个表达这个基因的组织，做个对照，看看 ...

恩，看别人文献都是取分蘖芽测的这几个基因，应该要表达的。请问会不会是退货温度的问题，我都设计的55度。
引物都加了，我分别测了MOC1，D3，D10,D27，不可能四次都没加引物。
另外，我引物放的时间有点长了，差不多四个月了，请问会不会是引物失活的原因？
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7楼2012-11-12 08:37:51
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ddf273634096

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-11 11:07:25
cDNA浓度太低，你最好控制CP值15-25之间，否则数据有效性影响较大。

问题是测的OSTB1和内参这个基因都出来了啊，CT值也都在30和20左右。其他几个基因CT值都很高，或者直接为NA。
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8楼2012-11-12 08:40:36
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ddf273634096

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-11 02:12:15
可能是MOC1在你测的组织的生长条件下丰度低，可以尝试适当增加做qPCR时cDNA的用量。实在不行的话可以在做反转录的时候加入3’引物。

恩，我等回去试试，另外请问可能是退火温度的原因吗？
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9楼2012-11-12 08:44:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by ddf273634096 at 2012-11-12 08:44:09
恩，我等回去试试，另外请问可能是退火温度的原因吗？...

你做qPCR前没有做一下引物的退火温度梯度吗？
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10楼2012-11-13 07:51:21
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