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新虫 (小有名气)

[求助] 跑荧光定量PCR,目的基因都是NA,内参基因均跑出来了,请问是怎么回事?

测的是水稻分蘖芽中的OSTB1,MOC1这2个目的基因,内参选的Actin。用的百乐的荧光定量机子。
第一次跑的OSTB1基因,CT值在28左右,同一重复内部三管的重复性还不错。
后面跑MOC1基因时,CT值是NA?请问是怎么回事?
引物均是来自文献。

OSTB1.jpg



MOC1.jpg
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新虫 (小有名气)

额,第二张图传错了,就是目标基因有的值是NA,请问怎么回事?
2楼2012-11-10 17:23:02
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-11-11 11:17:16
本身表达量太低。。。
还有,你确定下你的这个组织中确实表达这个基因吧。。。建议先做个普通PCR,看看表达不吧。。。
都不表达了,你这个差异也是没意义的了。或者,你可以找个表达这个基因的组织,做个对照,看看 ...

恩,看别人文献都是取分蘖芽测的这几个基因,应该要表达的。请问会不会是退货温度的问题,我都设计的55度。
引物都加了,我分别测了MOC1,D3,D10,D27,不可能四次都没加引物。
另外,我引物放的时间有点长了,差不多四个月了,请问会不会是引物失活的原因?
7楼2012-11-12 08:37:51
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-11 11:07:25
cDNA浓度太低,你最好控制CP值15-25之间,否则数据有效性影响较大。

问题是测的OSTB1和内参这个基因都出来了啊,CT值也都在30和20左右。其他几个基因CT值都很高,或者直接为NA。
8楼2012-11-12 08:40:36
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-11 02:12:15
可能是MOC1在你测的组织的生长条件下丰度低,可以尝试适当增加做qPCR时cDNA的用量。实在不行的话可以在做反转录的时候加入3’引物。

恩,我等回去试试,另外请问可能是退火温度的原因吗?
9楼2012-11-12 08:44:09
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