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你们都测哪些指标
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| 做有关植物的毒理实验，大家一般都测哪些指标呢?感觉自己测的指标好少，我测抗氧化酶系（SOD/POD/CAT），MDA，还想测个超氧阴离子（O2-），大家觉着有没有必要呢，是不是和前面哪个指标重复？另外大家给我推荐几个植物常测的方法比较成熟的指标啊. |
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starseacow
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gyfgood: 金币+20, 为专家的博学与热心鼓掌！ 2012-11-08 23:29:33
gyfgood: 金币+20, 为专家的博学与热心鼓掌！ 2012-11-08 23:29:33
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上一个帖子可能讲得太笼统。估计楼主是想研究某种物质处理植物造成的一系列和ROS迸发相关的反应。关于ROS工作，前一段时间我分享过一篇文章，你可以看看 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4835328 关于测哪些指标，重点在于你要解决什么问题，指标测的再多，说明不了任何问题，那就是浪费时间精力。现在可以说几乎所有外界刺激与损伤，都会引起ROS迸发，抗氧化酶系活性变化，那么你单纯测这些东西说实话没意义，就算发文章也顶多是灌水的水平。举个好文章的例子： Arabidopsis Nitric Oxide Synthase 1 Is Targeted to Mitochondria and Protects against Oxidative Damage and Dark-Induced Senescence Fang-Qing Guo and Nigel M. Crawford The Plant Cell December 2005 vol. 17 no. 12 3436-3450 这篇文章研究了线粒体NOS1对刺激的反应，以及NOS1带来的NO与ROS迸发的关系，并没有罗列一大堆各种各样抗氧化指标，而是为了证明自己的观点，认真的选取公认可信的方法，做出漂亮可信的结果。这样的工作解决问题，完整的讲了一个故事，所以可以发到顶级杂志。咱们现在做的工作离plant cell可能很遥远，但至少可以从想法和研究思路上向他们看齐。 我看过也解答过很多楼主的帖子，感觉你尝尝纠结于一些很细节的实验问题，这很可能是由于你所在实验组没有支持你的条件，可以理解，深表同情，我也愿意尽可能帮你解决这些问题。但我感觉更重要的是你需要对自己的课题有更深入和全面的思考，在研究到底怎么做某些实验之前，更重要的是明白你的课题涉及哪些内容，目前的最新研究进展是什么，有哪些问题还没有答案，自己如果要回答这些问题要怎么做等等。 |
3楼2012-11-05 18:41:06
starseacow
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2楼2012-11-05 17:02:35
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感谢你一直以来对我的帮助，我也发现了只要我发帖子一般都是等你来回答  ，感觉你挺厉害的。我的实验做的也挺纠结的，各种不会各种不明白，大学知识全白学了现在一点用不上，等于从头再来，老师给我定的课题又是我们实验室的先例，我是带头做的对我期望很大，师哥师姐不做这方面也没法帮我，更是难上加难，目前书上有的常规指标测的马马虎虎还算过关，老板就老是纠结于ROS和彗星实验上，因为他觉着这是我们实验室的特色。彗星太难了，小麦，单子叶植物，想取细胞核来做彗星，我就看过两篇文献，但一篇是培养的愈伤组织，还有一篇是直接养的小麦做的，而且作者是我以前的师哥，我现在天天联系他问，最后他都怕了，把博士论文发给我说：我真不记得当时怎么做的了你自己好好看看我的论文吧，而且一直劝我换指示生物，但是这是我们老师的国家自然基金的课题定的没法换。ROS我也了解了一些，最常用的就是DCFH-DA，而且我们实验室做动物的也是用这个方法，仪器软件啥的都准备好了，那个什么激光共聚焦显微镜我都没见过。。。，所以我研究了下他们动物的方法原理，感觉就是取线粒体再加探针最好能测荧光强度。我按这方法来试验了下，取植物线粒体再加探针测，试验阶段很成功，我以为行了，但是正式实验就出问题了，有的处理组没数据或很小，最近又试了好多次都不行，就是想不明白哪有问题，觉着是叶绿体影响了荧光强度，或者我没取到线粒体，但是以前就是这么做的。。我又用根尝试做，又有数据了，但是我前面指标全是用叶测的，这个用根测老板说不行。现在我就一直纠结于这两个指标，所以就想到了用其他指标代替。你推荐给我的这篇文章我看过，我觉着测O2-和测SOD是重复的，测H2O2和测CAT时重复的，所以想测个总的ROS，这种想法对不对? 另外我刚看了一篇文献测拟南芥ROS就是加探针测荧光强度，不知道你看过没？The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells. DENIS P. MAXWELL*, YONG WANG*, AND LEE MCINTOSH但是文献太笼统了，我老是从文献中学不到啥。 还有一点不明白的是，我看用DCFH-DA测ROS老提到什么六孔板什么的，感觉虽然都是用DCFH-DA法测的具体步骤也是不一样的。我们都是直接提取线粒体，计算蛋白，根据蛋白量确定加的线粒体酶液量，最后再以每毫克蛋白的荧光强度表示结果来表明ROS的量。你要是感兴趣的话我可以告诉你这个方法的具体，顺便也帮我研究下这个方法，看我的思路是否可靠？我们师哥用这方法刚发了一篇文章，关于斑马鱼的，在Aquatic Toxicology上，题目是Effects of the ionic liquid [Omim]PF6 on antioxidant enzyme systems, ROS and DNA damage in zebrafish (Danio rerio)你有兴趣可以看下。 |
4楼2012-11-05 19:50:02
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a71840584: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-09 23:14:40
a71840584: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-09 23:14:40
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动物的方法是否可以直接用在植物上，很难说。你的问题，很显然是叶绿体影响，这也就是为什么根做出来而叶子不行。关于活性氧迸发，测定各种活性氧和测定抗氧化酶是两个概念，不能互相替代。不同活性氧存在一定的相互转化，因为他们处于一个代谢系统内，同时，不同活性氧也有不同的信号作用，譬如我以前做过的工作显示某种次生代谢产物只受到H2O2调控，超氧和羟自由基并不影响。（当然，是否都要测定取决于你的实验目的，我以前搞次生代谢做活性氧，几个指标都测过，现在的组做活性氧，就考虑一个H2O2，照样出好文章。） 关于实验方法，我还是建议你使用别的做植物的文献上有报道的，且大家都用的方法。PNAS的方法讲得还算详细啊，有什么看不懂的？ |
5楼2012-11-05 21:15:50
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嗯，他这一段Detection of Reactive Oxygen Species. Spectrofluorometry. Intracellular production of ROS was measured by using 29,79- dichlorof luorescein diacetate (H2DCF-DA; Molecular Probes). This nonpolar compound is converted to the membrane- impermeant polar derivative H2DCF by esterases when it is taken up by the cell. H2DCF is nonfluorescent but is rapidly oxidized to the highly fluorescent DCF by intracellular H2O2 and other peroxides (20). Stocks of H2DCF-DA (5 mM) were made in ethanol and stored in the dark at 280°C under argon. H2DCF-DA was added to cells at a final concentration of 5 mM. After a 30-min incubation, cells were collected in a microcentrifuge, and the supernatant was removed and diluted 50-fold. Fluorescence was measured by using a Hitachi F2000 fluorescence spectrophotometer (Tokyo) with excitation and emission wavelengths set at 488 nm and 520 nm, respectively 这段讲的就是用荧光分光光度计去测荧光强度来表示ROS，我的方法和他基本一致，就是加的探针浓度不同（我是10mmol的探针稀释50倍）我不明白的是他说把探针加入细胞？哪来的细胞？直接从植物上分离得到的？取整个细胞不取线粒体？他的细胞不受叶绿体影响吗？还有他最后的结果表示的我也没看懂，他列的荧光强度是加了多少细胞后的？怎么这么表示吗？我们ROS表示都是像SOD和CAT一样是以每毫克蛋白所含的量来衡量的。 |
6楼2012-11-06 23:02:50
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【答案】应助回帖
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文章关于方法第一节就写着 Plant Material and Growth Conditions. Cultured tobacco cells (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) containing Aox1 in either sense (S11) or antisense (AS8) orientation have been characterized (9, 10). All experiments were conducted with exponentially growing cells 3–4 days after subculture 结果部分，测定ROS的图 Figure 1 Intracellular ROS abundance in WT and Aox1 transgenic cultured tobacco cells. |
7楼2012-11-07 00:25:13
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