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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western blot 出不来结果！！！
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山水506

铜虫 (初入文坛)

[求助] western blot 出不来结果！！！

各位达人，我刚开始做western，不过也做过好多次了，每一次要么是什么都没有，要么是有若隐若现的条带，结果总是不好。请问是怎么回事啊？
PS：用考马斯亮蓝染色，发现胶上基本没有蛋白了，可在曝光后用丽春红染膜后没有发现蛋白条带，但在网上查，说有的没染出来也能做出来啊！
谢谢各位了~~
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1楼 2012-11-03 11:51:03
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山水506

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by wsgcc at 2012-11-09 23:11:24
250mA转2个小时，是湿转还是半干转？如果半干的话30-40KD的分子量转的时间有点长了。我们这样的只转40-60分钟，还是用PVDF膜，它截留蛋白的能力要强于NC膜。另外：你一抗和二抗没有用错吧？譬如一抗是小鼠来源的， ...

是湿转。一抗和二抗应该没有问题，都是鼠来源的。。。
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17楼2012-11-12 21:23:33
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查看全部 18 个回答

wenzonglu

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考马斯亮蓝染不出条带，说明凝胶上没有蛋白，更不说转膜啦。先确定目的蛋白在凝胶上，可加标准蛋白来确定，加大上样量。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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山水506
2楼2012-11-03 14:23:16
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wsgcc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+1, 鼓励发高质量帖 2012-11-03 17:19:29
山水506: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢了 2012-11-07 21:21:42
Western是要比考染敏感，肉眼看不到的条带也wetstern可出条带。我觉得楼主的问题可以进行以下尝试：
1.可以同时跑两块一样的胶，一块直接考染，一块转膜后考染，进行一下对比；
2.买个预染蛋白Marker一起跑、转,这样转没转过去，一目了然，国产的预染Marker也不贵；
3.胶上蛋白没了，丽春红膜上没染出来，是不是转过了，直接到膜底下的滤纸上去了，用PVDF膜要好些。
以上仅供参考，祝实验顺利，呵呵。
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3楼2012-11-03 14:48:02
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遥控器68

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+1, 鼓励发帖！ 2012-11-03 17:19:38
山水506: 金币+2, ★有帮助 2012-11-07 21:22:08
在一块胶上点两遍样，一半考染一半转膜。
转的时候注意时间，可以换换显色方法。
抗体质量怎么样，工作用比例是多少刚做时候试个比较好的浓度出来。
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4楼2012-11-03 15:03:21
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