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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双链cDNA条带检测
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含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] 双链cDNA条带检测

大家好！我刚做了LD-PCR扩增出双链cDNA，用Thermo Scientific GeneRuler 1kb DNA ladder进行检测时，可以看到拖带，但是DNA ladder没有跑出全部条带，拖带不知大小范围。我做得是1.1%琼脂糖凝胶，电泳条件为50V，70min。我个人感觉，样3和样4的条带较好，样1的拖带不清晰，样2的条带也不太好，不知大家怎么看。此外，我想请教大家，大范围的Marker要什么样的电泳条件才能跑全条带呢？

双链cDNA电泳图.jpg
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努力，奋斗，拼搏。。。
1楼 2012-11-01 22:29:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你跑胶的电压太低，电泳时间过长。你可以加大电压跑快一些，前沿指示剂跑远一些。
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2楼2012-11-02 07:16:33
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 07:16:33
你跑胶的电压太低，电泳时间过长。你可以加大电压跑快一些，前沿指示剂跑远一些。

你好！是这样的，我之前电泳用过150V和100V，结果1kb DNA Ladder没有跑全条带，大的条带合在一起，看不清具体大小。我想，可能是电压太高，电泳时间太短引起的，所以又降低电压，延长时间做检测，结果仍然是这个样子......
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努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2012-11-02 09:26:09
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-02 13:46:12
个人建议，仅供参考！
1.0%琼脂糖胶（1 X TAE或0.5 X TBE），100V，由于配胶的模具不同，建议跑到前沿指示剂（溴酚蓝）至胶的2/3---4/5就可以了。个人感觉TBE跑出的结果好一点。而且低离子强度电流不会很大，电泳液发热不明显，对DNA和EB的降解作用都会弱很多。
样2的条带也不错，swear的很正常，大片段的也较多。
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4楼2012-11-02 10:15:11
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huangguoqing at 2012-11-02 10:15:11
个人建议，仅供参考！
1.0%琼脂糖胶（1 X TAE或0.5 X TBE），100V，由于配胶的模具不同，建议跑到前沿指示剂（溴酚蓝）至胶的2/3---4/5就可以了。个人感觉TBE跑出的结果好一点。而且低离子强度电流不会很大，电泳液 ...

谢谢帮忙！我制1.1%琼脂糖凝胶（0.5XTBE），100V电泳30min，结果也是一样，1kb DNA Ladder仍然没有没有跑全条带。电泳图如下：

电泳图.jpg
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5楼2012-11-02 14:36:49
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-11-02 14:36:49
谢谢帮忙！我制1.1%琼脂糖凝胶（0.5XTBE），100V电泳30min，结果也是一样，1kb DNA Ladder仍然没有没有跑全条带。电泳图如下：
3b/05/1418601_1351838195_425.jpg|3
电泳图.jpg
...

个人建议，仅供参考！
感觉你电泳时间还是太短了，你marker的1kb条带，连胶的一半都没过啊。而且，你marker的点样孔怎么会这么亮？
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6楼2012-11-03 11:19:35
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huangguoqing at 2012-11-03 11:19:35
个人建议，仅供参考！
感觉你电泳时间还是太短了，你marker的1kb条带，连胶的一半都没过啊。而且，你marker的点样孔怎么会这么亮？...

我也不知道为什么点样孔会亮，重新跑胶就是换电泳条件为50V，70min，就得到问题中的图了。那个，请问，你觉得电泳时间要延长到多长呢？我们实验室一般就是胶跑到一半就可以了。。。
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努力，奋斗，拼搏。。。
7楼2012-11-03 21:14:02
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jsccut

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我平时用 1kb 的电泳从来没有出现过这样的情况。是用1%胶，120V ，30min左右基本就可以了
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8楼2012-11-03 22:42:07
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-11-03 21:14:02
我也不知道为什么点样孔会亮，重新跑胶就是换电泳条件为50V，70min，就得到问题中的图了。那个，请问，你觉得电泳时间要延长到多长呢？我们实验室一般就是胶跑到一半就可以了。。。...

120V,45min左右,具体看实验器材和条件的不同再定。前沿指示剂跑到4/5左右的时候停止就可以，而且胶浓度越大这种大片段的DNA就越不容易分开。建议降低点，1.0%就完全可以了。
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含羞草liu
9楼2012-11-04 09:19:09
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by huangguoqing at 2012-11-04 09:19:09
120V,45min左右,具体看实验器材和条件的不同再定。前沿指示剂跑到4/5左右的时候停止就可以，而且胶浓度越大这种大片段的DNA就越不容易分开。建议降低点，1.0%就完全可以了。...

好的，我再试试，谢谢哦！
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努力，奋斗，拼搏。。。
10楼2012-11-04 09:33:31
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