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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 在PCR仪中，从95度均匀降温到25度，怎么弄才能90s降温1度？
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

[交流] 在PCR仪中，从95度均匀降温到25度，怎么弄才能90s降温1度？

最近，我要自己合成接头，接头的序列都知道，也从公司合成了单链，现在要把接头的两条单链通过退火来合成双链的。从网上看到碧云天的退火buffer，都说挺好使的，就买了。仔细阅读说明书后，才发现，里面有一个均匀退火的步骤，不好弄。是这样说的，每8s降温0.1度，如果PCR仪不具备这种功能的话，也可以90s降温1度。我从我们使用的PCR仪（ABI 2720）上，怎么弄都弄不好。从别的实验室找PCR仪，找到的能设置降温速度的，但是他们那里设置的*.*℃/s，看这格式，最慢的速度是0,1度每秒，而我要求的是0.01度每秒。又打算使用多不保温步骤来设置，90s降温1度，需要70步，但是PCR仪上最多六个HOLD 步骤。崩溃。。。。。。。
求助各位大仙们，有什么好的办法吗？
注：我从网上看到把水烧开，放到室内，把要退火的体系放进去，让开水自然冷却，之后就能使用。这个方法很不错的。但是我们老师听到这个方法后就直接给我回绝了。想想，开水自然冷却，开始的时候降温快，随后降温速度慢，整体降温不均匀，可能会影响实验。但是 ，在退火过程中，降温的快慢又有什么影响呢？在普通PCR过程中，退火时的降温速率很快的，引物同样能结合到模板上，而均匀降温又是何解？大仙们，给个答案吧！please！
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1楼 2012-10-25 10:58:23
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huxx

金虫 (小有名气)
★
dafeizizhu(金币+1): 谢谢参与
不需要那么严谨.  引物溶解后, 混一下, 加入PCR BUFFER. 至1X.     90s 冷却下来还是10min冷却下来都可以.    开水缓慢降温也可以.  水多冷却慢, 水少冷却快. 看着办.  那么短很容易结合的.
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16楼2012-10-25 15:56:02
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494750284

木虫 (小有名气)
★
dafeizizhu(金币+1): 谢谢参与
问过试剂盒的技术人员了吗，可能没有那么严格的要求，如果有的话看看他们是如何实现的。

[ Last edited by 494750284 on 2012-10-25 at 12:20 ]
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2楼2012-10-25 12:07:32
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wjswj

木虫 (正式写手)
★
dafeizizhu(金币+1): 谢谢参与
还是咨询技服人员吧，个人认为没必要那么严格。
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3楼2012-10-25 14:44:26
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