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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求原位杂交的技术protocol
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绿草如茵

木虫 (小有名气)

[求助] 求原位杂交的技术protocol

大家好，本人最近想做植物组织切片的原位杂交，以前做过都失败了，现在还需要做，求具体的操作流程，谢谢！不胜感激！
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！
1楼 2012-10-18 08:07:05
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.        制片
2.        制片处理：滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），盖上盖片。
80℃处理2min, 拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的梯度酒精中（70%，95%，100%酒精各5min或以上）。
3.        处理完自然干燥。
4.        配置杂交体系：
去离子甲酰胺              7.5µL
20×SSC                   1.5µL
ssDNA（鲑鱼精DNA）     1.5µL
B-DNA（封阻）           1µL
50%DS(葡聚糖)            3µL
Probe(最后关灯加)         1µL
上述体系配置完成后，瞬时离心（闭光），然后80℃变性10min。变性完后，迅速放到冰上处理5min以上。
5.        把上述体系滴加到玻片上，盖片，然后周围涂上无色指甲油保温密封。放入37℃饭盒里反应8h以上或过夜。
6.        用镊子将指甲油剥掉，将标本片浸入2×SSC的染色缸中，轻轻摇动使盖片脱落。
7.        再按照下列步骤清洗：
2×SSC   室温       5min
2×SSC   42℃       10min
2×SSC   室温       5min
1×PBS   室温       5min
离心管中加入0.5-1%抗小牛血清（用1×PBS配置）100µL，再加入1µL Fab,斡旋混匀，滴加到盖片上（滴加时标本不要太干燥），盖上盖片，37℃条件下，45min或以上。
8. 按照步骤7清洗
9.        自然闭光干燥后滴加PI，盖上盖片镜检。
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2楼2012-10-18 11:03:40
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-18 11:03:40
1.        制片
2.        制片处理：滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），盖上盖片。
80℃处理2min, 拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的梯度酒精中（70%，95%，100%酒精各5min或以上）。
3.        处理完 ...

谢谢，不胜感激！
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！
3楼2012-10-18 12:58:02
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-18 11:03:40
1.        制片
2.        制片处理：滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），盖上盖片。
80℃处理2min, 拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的梯度酒精中（70%，95%，100%酒精各5min或以上）。
3.        处理完 ...

“  7.5µL”请问这是什么意思？我不太理解，谢谢！
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！
4楼2012-10-18 13:00:36
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

微升。
拷贝的时候乱码了。。。。。
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5楼2012-10-18 13:39:29
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绿草如茵

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-10-18 13:39:29
微升。
拷贝的时候乱码了。。。。。

“Probe(最后关灯加)         1µL
你好，请问你是做的植物组织的原位杂交吗？你的探针浓度和杂交温度都是多少？B-DNA哪里买的啊？不好意思，问题太多了！不胜感激！
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！
6楼2012-10-23 10:46:58
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 绿草如茵 at 2012-10-23 10:46:58
“Probe(最后关灯加)         1µL
你好，请问你是做的植物组织的原位杂交吗？你的探针浓度和杂交温度都是多少？B-DNA哪里买的啊？不好意思，问题太多了！不胜感激！...

探针浓度根据物种有所区别，麦类作物一般用几十纳克足够了就。
杂交温度为37度避光过夜。
B-DNA有时不需要，B=BLOCKING, 只有在特殊情况下需要，例如，野草和小麦杂交后，鉴定小麦背景中的野草染色体时需要将小麦DNA打断用于与自身染色体杂交即用小麦DNA封阻小麦，这样用野草的DNA杂交时就只有野草DNA有信号。
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7楼2012-10-24 15:42:17
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