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绿草如茵木虫 (小有名气)
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[求助]
求原位杂交的技术protocol
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| 大家好，本人最近想做植物组织切片的原位杂交，以前做过都失败了，现在还需要做，求具体的操作流程，谢谢！不胜感激！ |
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绿草如茵
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3楼2012-10-18 12:58:02
chenguestc
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1. 制片 2. 制片处理：滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），盖上盖片。 80℃处理2min, 拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的梯度酒精中（70%，95%，100%酒精各5min或以上）。 3. 处理完自然干燥。 4. 配置杂交体系： 去离子甲酰胺 7.5µL 20×SSC 1.5µL ssDNA（鲑鱼精DNA） 1.5µL B-DNA（封阻） 1µL 50%DS(葡聚糖) 3µL Probe(最后关灯加) 1µL 上述体系配置完成后，瞬时离心（闭光），然后80℃变性10min。变性完后，迅速放到冰上处理5min以上。 5. 把上述体系滴加到玻片上，盖片，然后周围涂上无色指甲油保温密封。放入37℃饭盒里反应8h以上或过夜。 6. 用镊子将指甲油剥掉，将标本片浸入2×SSC的染色缸中，轻轻摇动使盖片脱落。 7. 再按照下列步骤清洗： 2×SSC 室温 5min 2×SSC 42℃ 10min 2×SSC 室温 5min 1×PBS 室温 5min 离心管中加入0.5-1%抗小牛血清（用1×PBS配置）100µL，再加入1µL Fab,斡旋混匀，滴加到盖片上（滴加时标本不要太干燥），盖上盖片，37℃条件下，45min或以上。 8. 按照步骤7清洗 9. 自然闭光干燥后滴加PI，盖上盖片镜检。 |
2楼2012-10-18 11:03:40
绿草如茵
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4楼2012-10-18 13:00:36
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5楼2012-10-18 13:39:29