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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建GFP融合基因时，如何设计带限制性内切酶的引物
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stonesby

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建GFP融合基因时，如何设计带限制性内切酶的引物

构建GFP融合基因，目的基因放GFP前面，需要去除终止密码子，具体如何去除？带限制性内切酶的引物如何设计？新手刚接触，请指教，谢谢
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1楼 2012-10-10 10:02:29
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stonesby

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-10-10 10:40:47
如果你是手动设计引物就直接将终止密码子去掉，然后在终止密码子前面选取18-21个碱基，再反向互补就是下游引物了。将选择好的内切酶（既要保证能切下来还要能连接上去）加上保护碱基直接放到设计好的引物序列上就OK ...

非常感谢，不过能否再进一步教授下，
1.为什么选取18-21个碱基？不是更多或者更少
2.如何选择内切酶?我要的基因是细胞膜蛋白，选的载体是pEGFP-N系列（N1,N2,N3,不知道选哪个）上面的多酶切位点有好多内切酶..
3.‘切记方向不要弄反了’是指保护碱基加的位置吗？
刚入门，望老手指点下，解答疑惑，这比自己去找资料更好吧
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3楼2012-10-20 09:32:22
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 回帖置顶 2012-10-10 16:29:34
1949stone: MolEPI+1, 很有指导意义 2012-10-10 16:29:53
如果你是手动设计引物就直接将终止密码子去掉，然后在终止密码子前面选取18-21个碱基，再反向互补就是下游引物了。将选择好的内切酶（既要保证能切下来还要能连接上去）加上保护碱基直接放到设计好的引物序列上就OK了。切记方向不要弄反了！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-10 10:40:47
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