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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：用BacterioMatch®II Two-Hybrid System对两个蛋白进行细菌双杂交
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 求助：用BacterioMatch®II Two-Hybrid System对两个蛋白进行细菌双杂交已有2人参与

1、如题，不知有谁用过这个系统进行细菌双杂交的实验？
2、XL1-Blue MRF´ Kan这个菌有三株，其实当验证两个特定的蛋白是否有相互作用时，是否用其中的任意一株都可以的？
3、如果两个蛋白确实是有相互作用的，在板上应该菌体应该长成什么样子？做到最后一步涂板后我的阳性对照、阴性对照还有目的菌长的都很小，菌体是否会长的比较大一点？是否会像DH5a或者Top10过夜在板上生长的样子？
谢谢！
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1楼2012-09-28 10:29:27
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11ychen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zhuifeng7000: 金币+5, ★有帮助, 感谢交流~ 2012-11-01 23:09:23
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流经验 2012-11-02 13:35:12
我之前也是做细菌双杂交的，XL1-Blue MRF´ Kan这个菌只是用于前期载体构建使用的，不可用于来两种蛋白相互作用的筛选，进行该步骤使用的是reporter competent cell。如果两种蛋白相互作用的话，在3-AT平板上可以长出一些单菌落，使用引物pBT F/R and pTRG F/R扩增时，是可以扩增出相应条带的。培养时间是需要很长（40h），不过结果还是可行的。不过它的菌落形态与DH5a不同。
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2楼2012-11-01 11:35:14
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 11ychen at 2012-11-01 11:35:14
我之前也是做细菌双杂交的，XL1-Blue MRF´ Kan这个菌只是用于前期载体构建使用的，不可用于来两种蛋白相互作用的筛选，进行该步骤使用的是reporter competent cell。如果两种蛋白相互作用的话，在3-AT平板 ...

我开始也有这个怀疑，但是我看了公司的protocol后发现其实XL1-Blue MRF这个菌的基因型和reporter competent cell是一模一样的，只不多不同的菌转化效率不同，其他的似乎没什么区别，从原理上来说的话只要激活报告系统就可以生长，XL1-Blue MRF也是含有报告系统的，所以我觉得用这个菌做后面的验证应该也没有问题吧？
非常感谢交流~
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3楼2012-11-01 23:08:59
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11ychen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhuifeng7000 at 2012-11-01 23:08:59
我开始也有这个怀疑，但是我看了公司的protocol后发现其实XL1-Blue MRF这个菌的基因型和reporter competent cell是一模一样的，只不多不同的菌转化效率不同，其他的似乎没什么区别，从原理上来说的话只要激活报告系 ...

这个我个人觉得还是有问题的，不知道你有没有尝试对XL1-Blue MRF进行共转化，我有试过，不知道是自己试验出问题了，还是本来就不可用于双杂家？当用引物扩增时，只有一种对应的蛋白条带出现？所以还是建议使用reporter cell。能否分享一下这些菌的基因型。谢谢！
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4楼2012-11-03 19:45:14
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xiaodi1010

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-09-30 09:03:16
XL1-Blue MRF这个菌的基因型和reporter competent cell是不一样的。
有个问题想请教一下： 我现在用这个系统做互作，阳性和阴性control都很好，但是检测相互作用都是阴性结果。而且验证文献报道的互作也是阴性结果。这个很令人费解。可以调整的条件试过很多。。。
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5楼2013-06-05 19:33:11
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaodi1010 at 2013-06-05 19:33:11
XL1-Blue MRF这个菌的基因型和reporter competent cell是不一样的。
有个问题想请教一下： 我现在用这个系统做互作，阳性和阴性control都很好，但是检测相互作用都是阴性结果。而且验证文献报道的互作也是阴性结果 ...

如果control都很好，文献报道的互作和你用的是相同的方法的话，我觉得最大的可能性是文献报道的实验有问题，而不是你的问题。如果用的不是相同的方法，有可能是因为不用的系统的敏感性及对于不同相互作用的的检测偏好性不同引起的，你可以尝试其他方法试一试。
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6楼2013-06-06 09:21:16
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吕随意

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-30 09:03:25
你好，我也想做几个基因的细菌双杂，但是载体什么的不知道哪里买，问了几家都是卖做文库的试剂盒，很贵，感觉买了用一点不合算，不知道你的这些都是那边买的？谢谢，期待回复
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7楼2013-09-29 22:30:08
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 吕随意 at 2013-09-29 22:30:08
你好，我也想做几个基因的细菌双杂，但是载体什么的不知道哪里买，问了几家都是卖做文库的试剂盒，很贵，感觉买了用一点不合算，不知道你的这些都是那边买的？谢谢，期待回复

我们这边的是老板问交大要的
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8楼2013-09-30 08:47:15
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xiaodi1010

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhuifeng7000: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-30 08:57:44
以下是两种菌的遗传背景，我认为还是不同的。我有尝试用两种菌同时实验，用XL1-Blue MRF‘ Kan菌株进行转化，连阴性control都可以长。
Validation Reporter Cells ：
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
endA1 hisB supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F′ laqIq HIS3 aadA Kanr]

XL1-Blue MRF′ Kan  ：  
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn5 (Kanr)].
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9楼2013-12-27 17:01:09
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xiaodi1010 at 2013-12-27 17:01:09
以下是两种菌的遗传背景，我认为还是不同的。我有尝试用两种菌同时实验，用XL1-Blue MRF‘ Kan菌株进行转化，连阴性control都可以长。
Validation Reporter Cells ：
Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
end ...

看基因型上面的没有问题，但是我用下面的菌也做出来了，所以应该也没有问题的。非常感谢~
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10楼2013-12-30 08:57:34
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