[交流] 样品蛋白组分SDS-PAGE鉴定有多条带，是否适合阴离子柱纯化之

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1楼2012-09-25 23:27:44

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meihuayi

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wizardfan: 回帖置顶 2012-09-27 06:07:43

引用回帖:

2楼: Originally posted by once1015 at 2012-09-26 09:48:16
实在太笼统，没办法给建议，希望你能把问题说详细一下。
比如什么来源蛋白组分，蛋白组分的大概性质等

BL21菌镍柱纯化后的蛋白，咪唑梯度洗脱。40mM除杂带，并且在此咪唑浓度下有目的蛋白洗脱下来，但不多。200mM咪唑将目的蛋白洗脱下来，SDS-PAGE胶鉴定主要为目的蛋白，但杂带也很多。想用阴离子柱再纯化，目的蛋白PI=6.15，阴离子柱PH9.0.不知这个策略是否可行？

18楼2012-09-26 23:27:32

meihuayi

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wizardfan: 回帖置顶 2012-09-27 06:07:58

劳驾高手继续作答，谢谢。200mM咪唑梯度最浓的带为目的蛋白。我主要是担心杂带会导致我目的蛋白沉淀在阴离子柱上。此前用阴离子柱纯化就碰见进样目的蛋白远多于洗脱出来的目的蛋白总和这种状况。希望有经验的虫子指点一二，或者告诉我用什么策略拿到较纯的目的蛋白。谢谢

1.jpg

[ Last edited by meihuayi on 2012-9-26 at 23:41 ]

20楼2012-09-26 23:34:07

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once1015

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实在太笼统，没办法给建议，希望你能把问题说详细一下。
比如什么来源蛋白组分，蛋白组分的大概性质等

2楼2012-09-26 09:48:16

gelois

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3楼2012-09-26 10:33:05

blackdogzmz

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虽然不懂,但帮顶一下,让别人来答........

4楼2012-09-26 10:51:46

gkf123

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应该可以

6楼2012-09-26 11:03:08

氢化大雪

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可以根据蛋白所带的不同电荷来进行离子交换分离

7楼2012-09-26 12:44:39

niurentian

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谢谢

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8楼2012-09-26 12:52:41

lyd850119

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不懂，帮顶

9楼2012-09-26 12:52:49

fool135

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可以试试，通常阴离子柱是过蛋白样的第一个柱子，可以看看穿透和洗脱液那部分含有你的蛋白

11楼2012-09-26 13:00:01

qianshengguo

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如果你是想去除杂带，一般在目的蛋白与杂带挂柱效果有明显差异的情况下，是可以用阴离子柱来纯化蛋白的。上样前需调节上样液的PH。另外要注意目的蛋白的PI。

14楼2012-09-26 15:28:41

aixia5

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可是试试，注意你的蛋白的PI。

15楼2012-09-26 15:54:55

xfyz102

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当然可以了。

16楼2012-09-26 16:44:52

meihuayi

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引用回帖:

3楼: Originally posted by gelois at 2012-09-26 10:33:05
你蛋白的PI是多少，还有杂带的分布是怎样，把胶图片发上来看一下。
什么都没有让人怎么讲啊。。。。

怎么发图呢？

19楼2012-09-26 23:31:39

meihuayi

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200mM咪唑梯度最浓的带为目的蛋白

21楼2012-09-26 23:34:56

gelois

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meihuayi: 金币+2, 谢谢你的关注，不知道你说的方法效果如何。我们实验室没这么做过，呵呵， 2012-09-27 19:35:11

你Step洗的浓度太大了，介意你将200mM咪唑Elu下来的Desalting成无咪唑的buffer重新过一次His柱，然后介意拉线性洗脱目的蛋白，如果条件有限不能拉线性的话，就把梯度变小，5mM，10mM，20mM,50mM,100mM.200，300，500，这样洗脱，ELU下来的目的蛋白就会比较纯。
这样之后再选取合适的合并过离子交换柱。因为看你的胶图片，有几条杂带离目的带很近，离子交换很难除，His的话或许可以。
你的PI值是6.1，那么阴离子的Buffer用7.5的就可以了，PH太高对蛋白也不好。过离子交换的话，也最好拉线性。

23楼2012-09-27 08:54:22