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小八儿11

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物

我自己设计了一对引物，进行PCR之后，琼脂糖凝胶电泳显示是我所要的大小，我就进行了正常的连接转化后测序，可是测序结果却不是我想要的，我想知道是不是引物出现了问题，还是哪里出现了问题，希望大家能帮我分析一下，万分紧急啊~~~
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1楼 2012-09-03 20:05:53
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-04 13:44:44
你的模板处理掉了么？
切胶回收了么？
测序结果是什么个情况？
用的是什么酶？
这些条件都写出来，不然我们怎么知道你的问题出在什么地方。
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2楼2012-09-04 10:49:55
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小八儿11

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-04 10:49:55
你的模板处理掉了么？
切胶回收了么？
测序结果是什么个情况？
用的是什么酶？
这些条件都写出来，不然我们怎么知道你的问题出在什么地方。

我pcr之后，进行了胶回收，使用的载体是pEASY，用的是全式金公司的TAP酶，测序结果就是在头部100bp左右能比对上，在末端100bp左右能比对上，比对匹配率只有7%左右。
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3楼2012-09-04 11:22:24
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小八儿11 at 2012-09-04 11:22:24
我pcr之后，进行了胶回收，使用的载体是pEASY，用的是全式金公司的TAP酶，测序结果就是在头部100bp左右能比对上，在末端100bp左右能比对上，比对匹配率只有7%左右。...

从你的结果上看，是你的基因没连接上啊。
你连接是双酶切连接还是普通的共转化连接？
你有没有做菌落PCR或者提出质粒后酶切鉴定？
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4楼2012-09-04 13:42:40
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小八儿11

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-04 13:42:40
从你的结果上看，是你的基因没连接上啊。
你连接是双酶切连接还是普通的共转化连接？
你有没有做菌落PCR或者提出质粒后酶切鉴定？...

应该是连接上了，我做菌液pcr也做质粒pcr了，但是没做酶切验证啊，是不是我设计的引物问题比较大啊？
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5楼2012-09-05 10:22:05
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jimmy7633

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测序最有说服力，估计你p出来的不是目的片段，你可以选用你目的片段中的一个酶切位点，再加上载体上的酶切位点，双酶切试试。
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6楼2012-09-05 10:31:28
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小八儿11 at 2012-09-05 10:22:05
应该是连接上了，我做菌液pcr也做质粒pcr了，但是没做酶切验证啊，是不是我设计的引物问题比较大啊？...

你如果都连接上了，那么和引物的关系就不是很大了
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7楼2012-09-05 12:40:19
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小八儿11 at 2012-09-05 10:22:05
应该是连接上了，我做菌液pcr也做质粒pcr了，但是没做酶切验证啊，是不是我设计的引物问题比较大啊？...

双酶切主要作用是缩小你需要测序的范围，减少测序资金。与你这个问题关系不大。
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爱是浅浅的喜欢，喜欢是浅浅的爱。
8楼2012-09-05 17:22:33
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