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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 扫描电镜样品前处理
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lovestrings

金虫 (小有名气)

[求助] 扫描电镜样品前处理

小女子做的是弧菌的电镜实验，曾经做过一次，按照下面的步骤做的，但是效果不好，细菌拍下来不立体。

将菌液以3000r /min转速离心10min后，弃上清液。注入 2.5%戊二醛，静置2h以上固定。固定后离心，将细菌沉积，弃上清，以蒸馏水重悬浮，重复3次，最后以蒸馏水重悬。分别用30%、50 %、70 %、80%、90%梯度浓度酒精脱水，每个梯度中静置 10min，脱水完毕，用纯酒精脱水 3次，每次30min，然后用纯叔丁醇置换酒精3次, 每次30min，最后吸取混匀的细菌-叔丁醇悬浮液滴在覆有盖玻片的样品台上，置冷冻干燥机内真空干燥。

有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？
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1楼2012-09-03 09:44:24
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416114799

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, MicEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-09-03 20:47:20
lovestrings: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 实在感谢了~~ 2012-09-04 15:44:39
小木虫: 金币+2, 帖子真精彩 2015-04-01 16:44:25
按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h→磷酸缓冲液洗涤 3 次→乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）→
乙酸异戊酯置换乙醇 2 次（20 min/次），每一步完成后经 8000 r/min 离心 5 min。将样品分别在 20℃、40℃和80℃冷冻 12 h，于冷冻干燥仪中干燥 12 h，备用。

我是这么做的。根据你的描述，有以下问题：①戊二醛固定时间不够；②洗涤液不能用水，必须用磷酸缓冲液PBS（1/15 mol/L，pH=7.2；配方：Na2HPO4*12H2O取23.876g+KH2PO4取9.078g，分别溶于1 L水中，然后将二者按照7:3的体积比混合（V:V），就可以了。）；③不知道你的戊二醛是怎么配的？戊二醛应该用以上的PBS来配置；④酒精梯度脱水，顾名思义就是要把水自由水除去，但是如果不按梯度，突然用100%来脱水是不行的，因为浓度太高，细胞形态就严重变形；按照我的这个梯度，我做出来非常漂亮；⑤ 在冷冻干燥前，必须把脱去自由水的样品按照从-20→-40→-80的梯度冷冻，目的把结合水固定住，梯度原理与④相同；⑥ 乙酸异戊酯的目的是置换掉乙醇，该药品神经毒，请在通风橱进行，不过只是有机物而已，偶尔接触没关系，不用怕。凡药品都有毒的。无法附图片，不然给你看看我拍的。希望对你有帮助。
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hnsfdj
做人做事要低调,默默践行心中的梦想.
3楼2012-09-03 20:18:12
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至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 木质心 at 2013-03-02 08:54:09
嘿嘿，我想请教您一下扫描电镜样品（我的是癌细胞）能在戊二醛里长时间保存吗？大概3~4天吧？...

估计不行吧。虽然戊二醛是固定剂，但是太久了肯定也出问题。又不像甲醛，防止尸体腐烂。呵呵
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27楼2013-03-02 09:23:37
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416114799

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
72楼: Originally posted by 15967146300 at 2018-06-05 16:05:57
您好，我想请问一下，SEM我是去浙大做的，我不明白其中一个步骤是PBS洗戊二醛和饿酸的时候为什么需要等待15min？麻烦您能抽出时间回复一下...

为了洗得更彻底啊！

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74楼2018-06-05 18:55:40
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至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

“有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？”这个肯定都要倒掉的啊？Ni都留着，然后继续加下一个？不要吓我。。。每一步，不仅仅是乙醇脱水这个，全都要弃上清啊。。我滴妈呀
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5楼2012-09-03 22:54:04
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至尊木虫 (知名作家)
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6楼: Originally posted by lovestrings at 2012-09-06 13:37:47
前辈，我的细菌样品如果处理好，4天后才能拍电镜的照片，会不会影响结果？如果不影响，我是放在-80℃里保存4天呢，还是放在-20℃呢？谢谢啦...

处理好了就是冷冻干燥了，这才叫处理好。如果还没条件冷冻干燥那就可以现在-80放着，要冷冻干燥了再拿去干燥。如果你是冷冻干燥后，要保存，只能放在有干燥剂的地方，如果你这个也不知道就没法指导了。好像你很多都不知道啊？说得也不清不楚，我往往要两头解释。
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7楼2012-09-06 14:01:22
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至尊木虫 (知名作家)
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11楼: Originally posted by humourhy at 2012-09-29 10:25:35
您好~我是在多孔聚酯支架上种细胞，然后放在SEM下观察~准备按照您提供的固定脱水细胞的方法来试一下~
我想请教下您两个问题 乙酸异戊酯替换乙醇这一步是不是决定性的一步呢，因为我的高分子支架很可能就被溶解了 ...

可以的哦，其实置换只是为了把乙醇除去，其实乙醇本来就很容易挥发的。我师姐做过没有用乙酸异戊酯置换的，效果也可以的啊。不影响哦
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humourhy
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12楼2012-09-30 08:31:31
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至尊木虫 (知名作家)
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22楼: Originally posted by scorpiodju at 2012-12-10 16:37:33
请问用乙醇脱水的时候也需要吹打均匀然后离心的么？...

当然的。你说呢？呵呵
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23楼2012-12-10 18:48:59
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至尊木虫 (知名作家)
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36楼: Originally posted by 哈皮果果 at 2014-02-24 17:27:21
你好，我想问下，用于固定的戊二醛是用磷酸盐缓冲液来配制，那么用于脱水的乙醇梯度需要用缓冲液来配制吗？非常感谢...

是的。都是用磷酸缓冲液配置的哦
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37楼2014-02-24 18:26:22
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至尊木虫 (知名作家)
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38楼: Originally posted by 哈皮果果 at 2014-02-24 20:28:25
好的，谢谢你哦，我做的是电镜观察菌丝在植物表面侵染的情况，样品处理和您说的一样吗？还是？...

应该都可以做的。没啥影响。你可以先试试。
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39楼2014-02-24 22:25:02
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至尊木虫 (知名作家)
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43楼: Originally posted by bunnyliu2008 at 2014-03-03 18:10:30
请问除了PBS要灭菌，戊二醛要灭菌吗？...

我都不灭，观察而已，不影响

[ 发自小木虫客户端 ]
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44楼2014-03-03 23:15:52
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至尊木虫 (知名作家)
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64楼: Originally posted by angledudu at 2015-09-28 16:57:45
恁好，想问一下，样品处理的时候，菌体量多少比较合适？哪一步往载玻片上点？...

一点点就够看了。sem放大1w多倍有几个菌就够啦

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65楼2015-09-29 00:09:07
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416114799

至尊木虫 (知名作家)
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71楼: Originally posted by xkc465540407 at 2018-01-26 16:58:15
您冷冻干燥仪的温度是多少度？谢谢你啊...

冷冻干燥仪还有温度？

发自小木虫Android客户端
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73楼2018-06-05 18:55:28
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lovestrings

金虫 (小有名气)
自己顶起来
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2楼2012-09-03 16:22:04
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416114799

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

补充一下：PBS也是保护细胞形态的，原理你应该懂得。
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4楼2012-09-03 20:21:11
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lovestrings

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 416114799 at 2012-09-03 20:18:12
按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h→磷酸缓冲液洗涤 3 次→乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）→
乙酸异戊酯置换乙醇 2 次（20 min/次），每一 ...

前辈，我的细菌样品如果处理好，4天后才能拍电镜的照片，会不会影响结果？如果不影响，我是放在-80℃里保存4天呢，还是放在-20℃呢？谢谢啦
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6楼2012-09-06 13:37:47
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416114799

至尊木虫 (知名作家)
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6楼: Originally posted by lovestrings at 2012-09-06 13:37:47
前辈，我的细菌样品如果处理好，4天后才能拍电镜的照片，会不会影响结果？如果不影响，我是放在-80℃里保存4天呢，还是放在-20℃呢？谢谢啦...

冷冻干燥的目的一是出去结合水，使电镜时不会被干扰。还有就是为了形态稳定，毕竟在处理过程中有了固定化的步骤。你还是好好理解下各个步骤的原理吧
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8楼2012-09-06 14:02:51
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lovestrings

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7楼: Originally posted by 416114799 at 2012-09-06 14:01:22
处理好了就是冷冻干燥了，这才叫处理好。如果还没条件冷冻干燥那就可以现在-80放着，要冷冻干燥了再拿去干燥。如果你是冷冻干燥后，要保存，只能放在有干燥剂的地方，如果你这个也不知道就没法指导了。好像你很多都 ...

我只不过想早点把样品处理好，我们学校里的电镜实验做起来要排队，我怕样品处理好了，不能保存，细菌会变形。你的意思就是不能马上做电镜实验，就先-80度冻起来，要拍电镜照片之前的12小时去冷冻干燥，省的干燥完了不能马上做实验，又吸潮了呗
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9楼2012-09-06 15:38:08
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至尊木虫 (知名作家)
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9楼: Originally posted by lovestrings at 2012-09-06 15:38:08
我只不过想早点把样品处理好，我们学校里的电镜实验做起来要排队，我怕样品处理好了，不能保存，细菌会变形。你的意思就是不能马上做电镜实验，就先-80度冻起来，要拍电镜照片之前的12小时去冷冻干燥，省的干燥完了 ...

是的。避免吸潮很简单啊，不是有那种避湿的设备啊？一个玻璃装置，里面放干燥剂那种
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10楼2012-09-06 16:09:07
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