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至尊木虫 (知名作家)

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专业: 环境微生物学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, MicEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-09-03 20:47:20
lovestrings: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 实在感谢了~~ 2012-09-04 15:44:39
小木虫: 金币+2, 帖子真精彩 2015-04-01 16:44:25

按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h→磷酸缓冲液洗涤 3 次→乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）→
乙酸异戊酯置换乙醇 2 次（20 min/次），每一步完成后经 8000 r/min 离心 5 min。将样品分别在 20℃、40℃和80℃冷冻 12 h，于冷冻干燥仪中干燥 12 h，备用。

我是这么做的。根据你的描述，有以下问题：①戊二醛固定时间不够；②洗涤液不能用水，必须用磷酸缓冲液PBS（1/15 mol/L，pH=7.2；配方：Na2HPO4*12H2O取23.876g+KH2PO4取9.078g，分别溶于1 L水中，然后将二者按照7:3的体积比混合（V:V），就可以了。）；③不知道你的戊二醛是怎么配的？戊二醛应该用以上的PBS来配置；④酒精梯度脱水，顾名思义就是要把水自由水除去，但是如果不按梯度，突然用100%来脱水是不行的，因为浓度太高，细胞形态就严重变形；按照我的这个梯度，我做出来非常漂亮；⑤ 在冷冻干燥前，必须把脱去自由水的样品按照从-20→-40→-80的梯度冷冻，目的把结合水固定住，梯度原理与④相同；⑥ 乙酸异戊酯的目的是置换掉乙醇，该药品神经毒，请在通风橱进行，不过只是有机物而已，偶尔接触没关系，不用怕。凡药品都有毒的。无法附图片，不然给你看看我拍的。希望对你有帮助。