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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 巢式PCR
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crystallynn

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR

用8f/1492r  和  L1401/U968   两对引物进行巢式PCR.
第一轮产物用琼脂糖检测有条带，阴性对照无条带。
第二轮产物检测也有目的条带，但是阴性对照也有相应大小的条带。把水，引物，MIX都更换了，一样的结果。求解释啊。。~~~~谢谢~
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1楼 2012-08-30 19:37:23
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励热心的虫虫 2012-09-04 13:45:28
我以前做巢式PCR也遇见过这种问题，把所有东西换了也出现这种情况，可能有两个原因：
1 由于巢式PCR高灵敏度和高特异性，模板中稍微一点点的污染都会扩增出条带，这在加样过程中由于我们看不见的液体飞溅而导致这种污染，这种就是加样时小心又小心，最好是预混所有溶液后再加样，戴手套操作。
2 你的内引物设计不够合理，本身存在很多缺陷，就会莫名其妙扩增出相应条带，这种是很难用一般理论去解释的，只能做到进一步优化引物。
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crystallynn
13楼2012-09-04 11:26:57
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得，应该是第二对引物特异性不好。可以把两个都测个序看。最好再换1对引物。
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2楼2012-08-31 07:17:28
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 07:17:28
个人觉得，应该是第二对引物特异性不好。可以把两个都测个序看。最好再换1对引物。

今天只用第对引物做了一下，果然阴性还是有很暗的条带。。。看了是第二对引物的问题。怎么对引物测序啊？谢谢
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3楼2012-08-31 11:55:46
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-05 13:52:15
引用回帖:
3楼: Originally posted by crystallynn at 2012-08-31 11:55:46
今天只用第对引物做了一下，果然阴性还是有很暗的条带。。。看了是第二对引物的问题。怎么对引物测序啊？谢谢...

不是对引物测序，对你的PCR产物测序。但是如果第一次PCR，阴性对照也有带就不好办了。说明你的水有问题，或者引物不特异或许在病毒或细菌中能扩增，或许灭菌不彻底？
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4楼2012-08-31 14:41:02
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