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crystallynn

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR

用8f/1492r  和  L1401/U968   两对引物进行巢式PCR.
第一轮产物用琼脂糖检测有条带,阴性对照无条带。
第二轮产物检测也有目的条带,但是阴性对照也有相应大小的条带。把水,引物,MIX都更换了,一样的结果。求解释啊。。~~~~谢谢~
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
个人觉得,应该是第二对引物特异性不好。可以把两个都测个序看。最好再换1对引物。
2楼2012-08-31 07:17:28
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crystallynn

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 07:17:28
个人觉得,应该是第二对引物特异性不好。可以把两个都测个序看。最好再换1对引物。

今天只用第对引物做了一下,果然阴性还是有很暗的条带。。。看了是第二对引物的问题。怎么对引物测序啊?谢谢
3楼2012-08-31 11:55:46
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-05 13:52:15
引用回帖:
3楼: Originally posted by crystallynn at 2012-08-31 11:55:46
今天只用第对引物做了一下,果然阴性还是有很暗的条带。。。看了是第二对引物的问题。怎么对引物测序啊?谢谢...

不是对引物测序,对你的PCR产物测序。但是如果第一次PCR,阴性对照也有带就不好办了。说明你的水有问题,或者引物不特异或许在病毒或细菌中能扩增,或许灭菌不彻底?
4楼2012-08-31 14:41:02
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lecou

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的阴性对照是什么,引物序列不是都是自己设计的,第二对引物出现目的还是污染的概率较大~
希望自己能平常心面对实验中的种种
5楼2012-08-31 14:41:12
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crystallynn

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 14:41:02
不是对引物测序,对你的PCR产物测序。但是如果第一次PCR,阴性对照也有带就不好办了。说明你的水有问题,或者引物不特异或许在病毒或细菌中能扩增,或许灭菌不彻底?...

第一轮空白没有条带的。
6楼2012-08-31 15:56:05
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crystallynn

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lecou at 2012-08-31 14:41:12
你的阴性对照是什么,引物序列不是都是自己设计的,第二对引物出现目的还是污染的概率较大~

空白啊,不加底物用灭菌的水代替。引物都分装过,第二轮引物也更换了。
7楼2012-08-31 15:56:55
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by crystallynn at 2012-08-31 15:56:05
第一轮空白没有条带的。...

第二次的分子量都一致??如果一致,那就把第一次和第二次的产物都测序看一下。连同阴性对照扩增出的带。
8楼2012-08-31 21:27:15
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wansanlian

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉应该也是特异性不强的原因~
乱花渐欲迷人眼
9楼2012-09-01 07:45:54
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baby1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
第一轮空白是因为PCR反应条件的关系,小片段没有竞争优势,或者温度不适合引物扩增。你做阴性对照的目的是什么?
加油。
10楼2012-09-01 13:42:04
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