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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 巢式PCR
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crystallynn

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR

用8f/1492r  和  L1401/U968   两对引物进行巢式PCR.
第一轮产物用琼脂糖检测有条带，阴性对照无条带。
第二轮产物检测也有目的条带，但是阴性对照也有相应大小的条带。把水，引物，MIX都更换了，一样的结果。求解释啊。。~~~~谢谢~
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1楼 2012-08-30 19:37:23
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得，应该是第二对引物特异性不好。可以把两个都测个序看。最好再换1对引物。
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2楼2012-08-31 07:17:28
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 07:17:28
个人觉得，应该是第二对引物特异性不好。可以把两个都测个序看。最好再换1对引物。

今天只用第对引物做了一下，果然阴性还是有很暗的条带。。。看了是第二对引物的问题。怎么对引物测序啊？谢谢
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3楼2012-08-31 11:55:46
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-05 13:52:15
引用回帖:
3楼: Originally posted by crystallynn at 2012-08-31 11:55:46
今天只用第对引物做了一下，果然阴性还是有很暗的条带。。。看了是第二对引物的问题。怎么对引物测序啊？谢谢...

不是对引物测序，对你的PCR产物测序。但是如果第一次PCR，阴性对照也有带就不好办了。说明你的水有问题，或者引物不特异或许在病毒或细菌中能扩增，或许灭菌不彻底？
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4楼2012-08-31 14:41:02
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lecou

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的阴性对照是什么，引物序列不是都是自己设计的，第二对引物出现目的还是污染的概率较大~
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希望自己能平常心面对实验中的种种
5楼2012-08-31 14:41:12
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-31 14:41:02
不是对引物测序，对你的PCR产物测序。但是如果第一次PCR，阴性对照也有带就不好办了。说明你的水有问题，或者引物不特异或许在病毒或细菌中能扩增，或许灭菌不彻底？...

第一轮空白没有条带的。
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6楼2012-08-31 15:56:05
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lecou at 2012-08-31 14:41:12
你的阴性对照是什么，引物序列不是都是自己设计的，第二对引物出现目的还是污染的概率较大~

空白啊，不加底物用灭菌的水代替。引物都分装过，第二轮引物也更换了。
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7楼2012-08-31 15:56:55
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by crystallynn at 2012-08-31 15:56:05
第一轮空白没有条带的。...

第二次的分子量都一致？？如果一致，那就把第一次和第二次的产物都测序看一下。连同阴性对照扩增出的带。
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8楼2012-08-31 21:27:15
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wansanlian

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉应该也是特异性不强的原因～
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乱花渐欲迷人眼
9楼2012-09-01 07:45:54
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baby1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一轮空白是因为PCR反应条件的关系，小片段没有竞争优势，或者温度不适合引物扩增。你做阴性对照的目的是什么？
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加油。
10楼2012-09-01 13:42:04
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